本文關鍵詞：HMGB1參與EAM心肌纖維化的機制及對固有免疫細胞功能的影響　出處：《江蘇大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 高遷移率族蛋白B1(HMGBl) 實驗性自身免疫性也肌炎(EAM) 也肌成纖維細胞 蛋白激酶C-P Runx3 妊娠相關性疾病

【摘要】：背景高遷移率族蛋白l(HMGB1),是一種重要的炎癥介質,可由免疫細胞和一些非免疫細胞主動分泌,或受損及壞死細胞被動釋放。HMGB1與許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關系,諸如：超敏反應、自身免疫性疾病、感染性疾病等。本實驗室已有的研究數(shù)據(jù)表明,HMGB1在實驗性自身免疫性心肌炎(EAM)小鼠心臟組織或血清中表達上調；封閉HMGB1可以改善EAM后期的心肌纖維化。然而,迄今為止,沒有數(shù)據(jù)能夠直接表明HMGB1與心肌纖維化的關系。據(jù)此,本研究旨在探討：①上調HMGB1有無可能直接導致EAM的心肌纖維化；②在EAM,心肌成纖維細胞／肌纖維母細胞能否分泌HMGB1,可否作為另一高水平]HMGB1源頭；③HMGB1阻斷能否有效地防止EAM后期的心肌纖維化。此外,對可能參與自身免疫性心肌炎的免疫失調因素進行了初步探討,包括Toll樣受體(TLR)及Runt相關轉錄因子3(Runx3)/CpG ODN對細胞增殖的影響,及其與IMGB1分泌或釋放的關系；妊娠相關疾病患者血清HMGB1的水平及作用。方法本研究所采用的試驗方法包括：流式細胞分析、實時熒光定量PCR試驗、Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、細胞培養(yǎng)和增殖試驗(MTT)、細胞遷移試驗以及組織病理學分析等。1.實驗性自身免疫性心肌炎小鼠模型的建立BALB/c小鼠,6-8周齡,由揚州大學實驗動物中心購買并在江蘇大學實驗動物中心飼養(yǎng)。本研究使用的所有動物試驗過程,均按實驗動物管理使用指南(美國國立衛(wèi)生研究院出版no.85-23,1996修訂)操作。小鼠實驗性自身免疫性心肌炎模型的誘導方法簡介如下：于0天和7天接種含有100ggMyHC-α(MyHC-α614-629; Ac-SLKLMATLFSTYASAD-OH)的1:1PBS/CFA乳化物。在接種的第54天,誘模小鼠經戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后頸椎脫位處死,并取相關檢材進行分析。所有實驗均獲江蘇大學研究與教學用動物實驗委員會批準。2.流式細胞儀分析研究選用了十五例慢性糖尿病患者、十四例妊娠糖尿病患者和十七例先兆子癇患者,年齡從19歲到41歲不等。經免疫熒光染色后,應用流式細胞儀分析計數(shù)外周血單個核細胞(PBMC)中Thl7細胞的比率。3.熒光定量]PCR (qRT-PCR)應用RT-qPCR方法,分別檢鋇TLR2、TLR4、TLR9、RAGE、HMGB1、Ⅰ/Ⅲ膠原(Col1/3)、骨橋蛋白(OPN)、Hlx、Runx3、MMP1和TIMP1/2的mRNA表達水平。4.免疫印跡Western blot檢測心肌成纖維細胞/肌纖維母細胞中膠原I、膠原]Ⅲ、P-PKC-β、p-EIK-1/2、f-erk-1/2和HMGB1的蛋白表達水平；同法檢測有或無CpG ODN誘導的A549細胞中Runx3的蛋白表達水平。5. ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)用于定量檢測慢性糖尿病患者、妊娠糖尿病和先兆子癇患者血漿中的干擾素γ、IL-17、IL-1β和高遷移率族蛋白l(HMGB1)的水平。6.細胞培養(yǎng)與增殖試驗根據(jù)參考文獻[31,32],取1-2周齡BALB/c小鼠,分離心臟成纖維細胞。細胞培養(yǎng)液DMEM(含10%胎牛血清)被用于培養(yǎng)心肌成纖維細胞。用MTT法檢測心肌成纖維細胞、肌成纖維細胞的增殖。同時,MTT法也用于分析CpG ODN對Runx3基因特異性siRNA轉染的細胞生長的影響。7.遷移試驗遷移試驗選用6孑LTranswell板與8-1m-pore-size聚碳酸酯過濾器。在有或無外源性HMGB1存在的條件下,分析心臟成纖維細胞和肌成纖維細胞的遷移作用。8.組織病理學分析HE染色方法用于觀察實驗性自身免疫性心肌炎模型的組織病理學改變；用Sirius red染色法檢測心肌纖維化；免疫熒光染色分析在脂多糖刺激下,心肌成纖維細胞、肌成纖維細胞分泌HMGB1的能力。9.統(tǒng)計分析所有數(shù)據(jù)均顯示為平均值士標準差(SD)。Student's test或雙向方差分析用于評價組間差異的顯著性。統(tǒng)計學分析采用GraphPad Prism 5和／或SPSS11.5軟件,P值0.05被認為有意義。結果我們的研究結果表明：1.HMGB1可能直接導致心肌膠原沉積,這與PKCβ/ERK1/2信號轉導通路相關；此外,在外部應力下,心肌成纖維細胞／肌纖維母細胞主動分泌HMGB1;心臟成纖維細胞／肌纖維母細胞分泌的HMGB1,可通過PKCβ激活以自分泌方式導致心肌纖維化。在EAM小鼠,阻斷HMGB1能有效地改善心臟的纖維化。2.在外部壓力下,HMGB1可從心臟成纖維細胞和肌成纖維細胞的細胞核穿梭至胞質。本研究還表明,除免疫細胞、內皮細胞、心肌細胞和壞死細胞外,同樣作為心臟重要組成的心臟成纖維細胞/肌纖維母細胞,是否在EAM時也充當HMGB1的重要來源。3.在妊娠相關疾病,升高的血漿HMGB1水平很有可能導致ILC的分化和隨后生產的IL-17。此外,在包括先兆子癇和妊娠糖尿病在內的妊娠相關性疾病中,增高的IL-17表達水平可能產生于ILC3,并在失控性炎癥應答時構成胎兒流產的威脅。4. CpG ODN可顯著抑制A549細胞的增殖。在CpG ODN刺激A549細胞,Runx3的表達在mRNA和蛋白水平均增多。CpG ODN對A549細胞增殖的抑制能力,在]Runx3基因siRNA轉染后受到明顯地控制。這一結果表明,TLR9活化和Runx3基因表達之間存在著密切的關系,也可能與HMGB1分泌有關,需要進一步證實。結論本研究表明,HMGB1可通過PKCβ/ERK1/2-依賴的信號通路直接導致心肌膠原沉積；在外界應力下,心肌成纖維細胞/肌纖維母細胞分泌的HMGB1,通過激活PKCβ以自分泌的方式導致心臟的纖維化；封閉HMGB1都能有效地改善EAM小鼠的心肌纖維化。此外,在妊娠相關疾病的血漿中,HMGB1增高并可導致ILC的分化和隨后產生IL-17、TLR9活化與RUNX3基因表達,參與某些細胞的生長調控,并推測可能與IMGB1的分泌相關。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2

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本文編號：1330015