本文關鍵詞：自噬在主動脈瓣鈣化和ROS介導的瓣膜間質細胞損傷中的作用及機制研究　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景鈣化性主動脈瓣膜狹窄(Calcific aortic valve stenosis,CAVS)的發(fā)病率位居心血管疾病中的第三位,表現(xiàn)為主動脈瓣的纖維化、鈣化以及瓣葉交界處的融合,從而造成瓣口面積的狹窄。由于其具體的發(fā)病機制尚未明了,目前只能通過置換人工瓣膜的方式進行治療�；A研究的進展提示,主動脈瓣鈣化不僅是一個細胞萎縮凋亡導致鈣鹽被動沉積的過程,還涉及瓣膜間質細胞向成纖維母細胞和類成骨細胞的轉分化。瓣膜間質細胞是維持主動脈瓣正常形態(tài)和生理功能的主要執(zhí)行者,其體外鈣化模型作為一種有效工具被廣泛應用于CAVS的機制和藥物研究中。氧化應激(Oxidative stress)是氧化還原系統(tǒng)失衡后活性氧簇(ROS)在細胞內堆積并造成組織損傷的過程。近年研究發(fā)現(xiàn),ROS水平在鈣化的主動脈瓣中升高,與抗氧化酶的減少有關,并能引起瓣膜間質細胞的DNA損傷和早期活化。越來越多的證據(jù)表明氧化應激/ROS與細胞自噬之間存在著緊密而復雜的聯(lián)系。自噬(Autophagy)是一種對細胞成份進行自我消化并實現(xiàn)再循環(huán)利用的現(xiàn)象,在生物體內廣泛存在且在進化中高度保守,是近十年來基礎醫(yī)學研究的一大熱點。ROS被認為能對自噬進行正向或負向的調節(jié),而自噬也能通過降解氧化還原相關的蛋白和細胞器影響ROS。然而,自噬現(xiàn)象并沒有在CAVS中得到深入、可靠的研究,而氧化應激與自噬的關系在主動脈瓣鈣化領域中還未見報道。目的(一)觀察自噬現(xiàn)象對鈣化性主動脈瓣狹窄及瓣膜間質細胞體外鈣化過程中發(fā)生的情況。(二)明確自噬對主動脈瓣鈣化及其中伴隨的細胞損傷/凋亡的影響和具體機制。(三)探索氧化應激與自噬在主動脈瓣鈣化過程中的相互作用及具體機制。方法(一)瓣膜標本及細胞培養(yǎng)1、臨床標本的收集與處理:收集在我科行瓣膜手術的CAVS患者的鈣化性主動脈瓣標本以及纖維化增厚的主動脈瓣,以尸檢或心臟移植患者的瓣膜為正常對照組,將組織標本迅速固定于福爾馬林或凍存于液氮中以待檢測。2、豬來源主動脈瓣膜間質細胞(PAVICs)的分離:將豬主動脈瓣切除后,置于Ⅰ型膠原酶中37℃消化10分鐘,使用滅菌棉簽將表面的而瓣膜內皮細胞擦除,再置于Ⅱ型膠原酶中37℃震蕩消化2小時,過濾、離心后重懸。3、PAVICs的鑒定:使用免疫熒光法對PAVICs進行間質細胞標記物Vimentin、成纖維細胞標記物α-SMA、內皮細胞標記物CD31的檢測。4、PAVICs的培養(yǎng):使用含雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),實驗使用3-6代細胞,每2-4天換液。(二)體外成骨誘導及鈣化相關的檢測1、體外鈣化模型的建立:使用配方分別為2m M磷酸二氫鈉、50μg/ml抗壞血酸、107M胰島素和10m Mβ-磷酸甘油鈉、50μg/ml抗壞血酸、100n M地塞米松的兩種鈣化培養(yǎng)基(OIM-1/2)誘導PAVICs成骨,發(fā)生鈣鹽沉積所需的培養(yǎng)時間分別為7天和21天。2、瓣膜間質細胞向類骨母細胞轉分化的檢測:通過免疫印跡法檢測α-SMA和成骨標志物RUNX2、OPN的表達;使用BCIP/NBT堿性磷酸酶染色法檢測ALP的表達。3、鈣鹽沉積的檢測:配制p H=4.3的1%茜素紅S染色液對鈣結節(jié)進行染色。(三)自噬的檢測及干預方法1、形態(tài)學檢測:使用透射電子顯微鏡對瓣膜組織標本中自噬體、自噬溶酶體等自噬相關結構進行直接觀察。2、組織中自噬水平的分析:通過免疫組織化學、免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3、BECN1、ATG5、ATG7的表達水平;使用免疫熒光雙標檢測BECN1與Vimentin的共定位。3、PAVICs中自噬體的形成及相關通路的檢測:配合巴伐洛霉素A1,通過免疫印跡法檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ的轉化比、自噬相關蛋白、p-AKT(ser473)和p-P70S6K(Thr389)的表達。4、PAVICs中自噬流的發(fā)生:免疫印跡法檢測P62的降解;GFP-m RFP-LC3雙熒光示蹤系統(tǒng)檢測檢測自噬體的形成以及自噬體和溶酶體的結合。5、自噬的干預:使用雷帕霉素增強自噬;渥曼青霉素和氯喹抑制自噬;構建自噬關鍵基因BECN1的干擾腺病毒,特異性地抑制自噬。(四)氧化應激的誘導、干預及細胞損傷相關的檢測1、氧化應激模型的構建:使用含100~1000μM過氧化氫的完全培養(yǎng)基刺激PAVICs 0.5小時~14天。2、活性氧水平的檢測:使用2',7'-DCFH綠色熒光探針標記活性氧,通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀定量分析。3、氧化應激的干預:應用N-乙酰半胱氨酸清除PAVICs內的活性氧。4、細胞毒性分析:使用CCK-8法測定細胞的活性;使用乳酸脫氫酶釋放實驗檢測細胞膜的損傷。5、細胞凋亡的干預和檢測:應用Caspase通路抑制劑Z-Vad-FMK抑制細胞凋亡;使用Annexin V/PI雙標記PAVICs,并通過流式細胞術定量分析早/晚期凋亡的比例;通過免疫印跡法檢測Caspase3、PARP的剪切體/前體比例反應細胞凋亡中Caspase途徑激活的程度。結果(一)鈣化性主動脈瓣狹窄中自噬水平的檢測。在透射電鏡下可以觀察到纖維化主動脈瓣中有較多的自噬體,鈣化的主動脈瓣細胞中存在大量的自噬體和自噬溶酶體,而正常的瓣膜中只能找到少量的自噬前體。免疫組織化學結果顯示自噬相關蛋白LC3、BECN1、ATG5、ATG7在纖維化和鈣化的瓣膜中的陽性表達高于正常瓣膜;免疫印跡半定量分析提示在CAVS標本中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例顯著升高,BECN1和ATG5都有不同程度的高表達,而ATG7在三組之中未見明顯差異。免疫熒光雙標記的結果表明自噬關鍵基因BECN1在Vimentin陽性的瓣膜間質細胞中出現(xiàn)了強陽性,證明在纖維化、鈣化的主動脈瓣中,瓣膜間質細胞的自噬水平升高。(二)主動脈瓣膜間質細胞體外鈣化模型中自噬的水平及功能研究。經(jīng)免疫熒光鑒定后,使用改良的膠原酶兩步消化法分離的豬來源主動脈瓣膜間質細胞(PAVICs)未受內皮細胞的污染。在兩種鈣化培養(yǎng)基(OIM-1/2)培養(yǎng)PAVICs的過程中,OPN和RUNX2表達明顯升高,α-SMA降低,ALP染色陽性,提示PAVICs由成纖維細胞轉分化為類骨母細胞;茜素紅染色顯示OIM-1/2都能使體外培養(yǎng)的PAVICs出現(xiàn)大量的鈣鹽沉積。使用OIM-1/2短期(24小時)刺激PAVICs后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增加,P62減少,巴伐洛霉素進行干預后OIM-1/2中PAVICs的LC3-Ⅱ相對于對照組仍然增加,提示了自噬的發(fā)生;通過GFP-m RFP-LC3示蹤系統(tǒng)也直觀的觀察到了自噬體和溶酶體的結合;而在OIM-1/2長期(4~21天)的培養(yǎng)過程中,BECN1、ATG5、ATG7的表達均有不同程度的升高。當使用自噬藥物對體外鈣化模型進行干預時,誘導劑雷帕霉素能夠顯著地緩解鈣鹽沉積,而抑制劑渥曼青霉素和BECN1干擾腺病毒加重了鈣化程度;免疫印跡分析顯示雷帕霉素干預后,PAVICs在OIM-1/2中OPN、RUNX2表達減少,α-SMA表達水平恢復,ALP染色陽性強度減弱,而渥曼青霉素和sh BENC1的作用與之相反,提示自噬能夠通過延遲PAVICs向類骨母細胞轉分化以緩解主動脈瓣鈣化的發(fā)生。另外,在鈣化培養(yǎng)基誘導的中途應用雷帕霉素也能減輕最終的鈣化。(三)自噬在主動脈瓣膜間質細胞氧化應激模型中的水平和作用。2',7'-DCFH-DA探針標記和免疫印跡結果分別顯示體外鈣化模型中PAVICs內的活性氧水平升高并發(fā)生了Caspase途徑依賴的凋亡,使用N-乙酰半胱氨酸清除ROS后行流式檢測發(fā)現(xiàn)鈣化培養(yǎng)基中PAVICs的凋亡減少,而N-乙酰半胱氨酸(NAC)和凋亡抑制劑Z-Vad-FMK都能夠明顯抑制PAVICs的鈣化程度,揭示了氧化應激及其引發(fā)的細胞凋亡是主動脈瓣鈣化的重要機制。通過對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及P62的檢測發(fā)現(xiàn)自噬在PAVICs氧化應激模型中的發(fā)生呈濃度依賴式,而NAC能抑制自噬的發(fā)生。不同時間點(0.5~12小時)的檢測提示過氧化氫誘導PAVICs時通過PI3K-AKT-m TOR通路激活自噬。結合巴伐洛霉素A1的干預和GFP-m RFP-LC3示蹤系統(tǒng),可以觀察到氧化應激模型中自噬體的形成和完整自噬流的發(fā)生。NAC在體外鈣化模型中也能抑制自噬,提示主動脈瓣鈣化過程中的自噬現(xiàn)象至少部分由氧化應激引起。在長期的氧化應激模型中,BECN1、ATG5、ATG7在第7天時表達升高,而在14天時表達減少。細胞活性檢測結果顯示Z-Vad-FMK能顯著提高PAVICs在250~750μM過氧化氫下的存活率,提示凋亡是細胞在氧化應激模型中發(fā)生死亡的主要方式。CCK8和LDH細胞損傷檢測顯示,使用自噬藥物進行干預后,雷帕霉素能在不同時間點、不同過氧化氫濃度下提高細胞活性、降低細胞的損傷,而渥曼青霉素和氯喹會加重其損傷和死亡。隨后的凋亡檢測也得出一致的結果,增強自噬能夠顯著緩解PAVICs的細胞凋亡和Caspase途徑的激活,而抑制自噬后有著相反的影響。最后通過流式細胞術對2',7'-DCFH-DA標記的各處理組進行定量分析后發(fā)現(xiàn),自噬是通過清除細胞內過度堆積的活性氧而發(fā)揮其對PAVICs的保護作用的。結論氧化應激在主動脈瓣鈣化的過程引起了瓣膜間質細胞高水平的自噬現(xiàn)象,自噬不僅能通過清除過量的ROS減輕氧化應激介導的瓣膜間質細胞損傷/凋亡,還能在體外鈣化模型中抑制瓣膜間質細胞向類骨母細胞轉分化從而緩解其鈣化程度。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R542.52

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本文編號：1319780