本文關(guān)鍵詞：microRNA-205在子宮內(nèi)膜癌中的促癌作用及分子機制　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第一部分microRNA-205高表達預(yù)測子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并提示不良預(yù)后研究背景:在全世界范圍內(nèi),尤其在歐美國家,子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率最高的惡性腫瘤。在中國婦女中,近年來由于生活方式及代謝性疾病等原因,子宮內(nèi)膜癌發(fā)生率有增加的趨勢。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的主要因素之一。淋巴結(jié)切除術(shù)(或淋巴結(jié)清掃術(shù))作為子宮內(nèi)膜癌系統(tǒng)手術(shù)分期的組成部分,其在手術(shù)治療療效及對患者生存獲益方面的作用一直存在爭議,尤其在術(shù)前診斷為臨床Ⅰ期的患者中,既包括大部分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低的低風險患者,也包括少部分淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高的高危患者。為了將可能從淋巴結(jié)切除術(shù)中獲益的高危患者的手術(shù)效果最大化,而對于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低的低風險患者,能否避免不必要的淋巴結(jié)清掃術(shù)所引起的手術(shù)并發(fā)癥,我們需要術(shù)前對子宮內(nèi)膜癌患者尤其是術(shù)前診斷為臨床Ⅰ期的患者進行淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風險分層評估。術(shù)前子宮內(nèi)膜組織活檢病理參數(shù)如組織學類型和分化程度對預(yù)判子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定參考價值,但其準確性仍有待提高。最近的一些研究一致地顯示在子宮內(nèi)膜癌中miR-205表達上調(diào)并且與患者不良預(yù)后相關(guān),然而miR-205能否作為預(yù)測子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的分子指標尚未見報道。研究目的:本研究嘗試探討miR-205在子宮內(nèi)膜癌診斷性刮宮術(shù)活檢標本中的表達是否能在術(shù)前即預(yù)測并篩檢出子宮內(nèi)膜癌尤其是術(shù)前診斷為臨床Ⅰ期的患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的高�；颊�;同時進一步驗證miR-205作為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后分子標記物的作用。方法:我們采用熒光定量PCR方法同時檢測了 360例子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前診刮術(shù)活檢組織以及子宮切除術(shù)后的石蠟切片組織標本中miR-205的相對表達。以子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前診刮術(shù)活檢組織標本中miR-205的相對表達,以及聯(lián)合診刮術(shù)活檢標本中組織分類及分化程度作為預(yù)測因子,研究其在所有子宮內(nèi)膜癌患者及術(shù)前診斷為臨床Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌患者中預(yù)測并篩檢淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高�；颊叩拿舾行�,特異性,陽性似然比,陰性似然比,并應(yīng)用ROC(receiver operating characteristic curve,受試者操作特征曲線)評估m(xù)iR-205作為預(yù)測指標的效能。除此之外,還應(yīng)用(Kaplan-Meier method,乘積極限法),Log-rank檢驗以及Cox比例風險模型進行生存分析。結(jié)果:1.與正常子宮內(nèi)膜組織相比,miR-205在子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前診刮術(shù)活檢組織以及子宮切除術(shù)后的石蠟組織切片標本中一致地表現(xiàn)為高表達,均有統(tǒng)計學差異。2.與Ⅰ型(子宮內(nèi)膜樣癌)、中-高分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者相比,術(shù)前診刮術(shù)活檢組織以及子宮切除術(shù)后的組織切片標本中均發(fā)現(xiàn)miR-205在Ⅱ型(特殊類型,如漿液性癌)、低分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者中相對表達水平更高,均有統(tǒng)計學差異。3.在術(shù)前診斷臨床分期為Ⅰ期的患者中,以miR-205表達升高≥14.5倍預(yù)測患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的敏感性,特異性,陽性似然比,陰性似然比分別為72.5%,84.2%,4.56和0.32,總體準確性為83.0%;以R0C評估m(xù)iR-205作為預(yù)測指標的效能,結(jié)果曲線下面積=0.821(P=0.004;95%置信區(qū)間,0.666-0.975)。如果將術(shù)前診刮術(shù)活檢組織miR-205的表達與組織類型及分化程度兩項參數(shù)聯(lián)合起來預(yù)測患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,預(yù)測效能會得到進一步提高,敏感性,特異性,陽性似然比,陰性似然比分別為82.7%,83.8%,5.19和0.20,總體準確性為83.7%。4.同時,miR-205在子宮內(nèi)膜癌診刮術(shù)活檢組織以及子宮切除術(shù)后的石蠟組織切片標本中的高表達均提示與患者不良預(yù)后相關(guān)。結(jié)論:在本研究數(shù)據(jù)條件下,子宮內(nèi)膜癌患者診刮術(shù)活檢組織標本中miR-205的高表達能夠以較高的準確性預(yù)測術(shù)前診斷為臨床Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險。當并聯(lián)結(jié)合子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前診刮術(shù)標本中組織分型及分化程度兩項參數(shù)時,預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準確性進一步提高。由此表明,miR-205在子宮內(nèi)膜癌術(shù)前活檢標本中的高表達增加了子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險分層評估的準確性。此外,本研究再次顯示miR-205在子宮內(nèi)膜癌組織中的高表達預(yù)示著患者的不良預(yù)后。第二部分microRNA-205通過靶向PHLPP2在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮促癌作用研究背景:子宮內(nèi)膜癌在美國是發(fā)病率第一位的女性生殖道惡性腫瘤。近年來,在我國北京、上海等較發(fā)達城市子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率上升,超越宮頸癌,成為婦女生殖器官最常見的惡性腫瘤。約75%左右子宮內(nèi)膜癌可以得到早期診斷,而且子宮內(nèi)膜癌中80%以上為Ⅰ型(子宮內(nèi)膜樣腺癌),因此大部分子宮內(nèi)膜癌經(jīng)過及時的以手術(shù)為主的綜合治療預(yù)后較好。然而有小部分(約15%-25%)分化差、侵襲性強的子宮內(nèi)膜癌,如Ⅰ型低分化,晚期及Ⅱ型(如漿液性癌、透明細胞癌、腺鱗癌等)子宮內(nèi)膜癌,即使患者接受了包括手術(shù)、放療、化療及內(nèi)分泌等治療,仍然會出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移以及對化療、內(nèi)分泌治療的耐藥現(xiàn)象,導致治療失敗,患者只能獲得短期生存,最終仍會死于復(fù)發(fā)、耐藥及病情進展。這部分患者常規(guī)治療效果不理想,預(yù)后差,是目前亟待解決的臨床問題。研究表明分子靶向治療在癌癥治療領(lǐng)域如黑色素瘤、肺癌及乳腺癌中顯示出了一定的療效。在子宮內(nèi)膜癌中,對于特殊類型、惡性程度高及易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的這些病例,在常規(guī)治療效果差的情況下,探索研究新的、潛在的可用于靶向治療的分子靶標具有重要的臨床意義及應(yīng)用前景。研究目的:本部分研究在第一部分實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,擬進一步探討:1.miR-205在人子宮內(nèi)膜癌細胞及人正常子宮內(nèi)膜上皮細胞中的表達情況;2.miR-205在人子宮內(nèi)膜癌細胞中發(fā)揮什么樣的生物學功能;3.miR-205發(fā)揮功能可能的作用機制。從而進一步驗證miR-205是否有希望成為子宮內(nèi)膜癌潛在的靶向治療的靶點。實驗方法:FQ-PCR(熒光定量PCR)檢測三株人子宮內(nèi)膜癌細胞(Ishikawa、HEC-1-A及AN3CA)和人正常子宮內(nèi)膜上皮細胞(CP-H058)中的內(nèi)源性miR-205的表達水平。轉(zhuǎn)染miR-205 mimics或者miR-205 inhibitor上調(diào)或者敲低人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-205的表達,CCK-8實驗及平板克隆實驗測試調(diào)控miR-205的表達后細胞增殖活力的改變;Transwell侵襲實驗檢測miR-205過表達或者低表達對子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲能力的影響。流式細胞術(shù)檢測上調(diào)或者下調(diào)miR-205的表達對子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的影響。接下來,經(jīng)生物信息學數(shù)據(jù)庫預(yù)測并參考文獻篩選出 PHLPP2(pleckstrin homology domain leucine-rich repeat protein phosphatase 2,具有PH結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸的磷酸酶2)為miR-205的靶基因;轉(zhuǎn)染miR-205 mimics或者miR-205 inhibitor增強或者降低人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-205的表達,雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測驗證miR-205是否靶向結(jié)合并作用于PHLPP2的3'非翻譯區(qū);Western blotting(免疫印跡法)檢測PHLPP2蛋白表達的變化。此外,以免疫組織化學染色法檢測PHLPP2在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達,結(jié)合第一部分miR-205在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達,分析二者在子宮內(nèi)膜癌組織中表達的相關(guān)性。結(jié)果1.三株子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-205的相對表達均高于正常人子宮內(nèi)膜上皮細胞且有統(tǒng)計學差異(P0.01)。三株子宮內(nèi)膜癌細胞內(nèi)源性miR-205的相對表達水平由低到高依次為Ishikawa、HEC-1-A及AN3CA。2.外源性上調(diào)Ishikawa和HEC-1-A細胞中miR-205的表達(轉(zhuǎn)染miR-205 mimics寡核苷酸),與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,能夠促進這兩種子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖(P0.01)及侵襲能力(P0.01)。3.外源性下調(diào)AN3CA和HEC-1-A細胞中miR-205的表達(轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor),與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,能夠抑制這兩種子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖活性(P0.01)及侵襲性(P0.01)。4.Ishikawa細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 mimics,與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,降低了Ishikawa細胞的凋亡率。AN3CA細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor,與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,增加了 AN3CA細胞的凋亡率。5.經(jīng)TargetScan7.1和miRBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)PHLPP2 mRNA的3'非翻譯區(qū)含有miR-205的結(jié)合序列。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示:在Ishikawa細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 mimics過表達miR-205,作用于PHLPP2mRNA的3'-非翻譯區(qū)(野生型,包含miR-205結(jié)合位點正常序列),與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,能夠降低相對熒光素酶活性。而在Ishikawa細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 mimics過表達miR-205,作用于PHLPP2 mRNA的3'-非翻譯區(qū)(突變型,miR-205的結(jié)合位點含突變點),與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,不能改變熒光素酶活性。同樣地,在AN3CA細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor 下調(diào) miR-205 的表達,作用于 PHLPP2 mRNA 的 3'-非翻譯區(qū)(野生型,包含miR-205結(jié)合位點正常序列),與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,能夠增高相對熒光素酶活性。而在AN3CA細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor下調(diào)miR-205的表達,作用于PHLPP2 mRNA的3'-非翻譯區(qū)(突變型,miR-205的結(jié)合位點含突變點),與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,不能改變相對熒光素酶活性。Western blotting結(jié)果表明:與轉(zhuǎn)染陰性對照相比,在Ishikawa細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 mimics能降低PHLPP2蛋白表達水平,而在AN3CA細胞中轉(zhuǎn)染miR-205 inhibitor升高了PHLPP2蛋白表達水平。證實miR-205直接靶向結(jié)合在PHLPP2mRNA的3'-非翻譯區(qū),在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)控PHLPP2的表達。6.免疫組織化學實驗顯示PHLPP2在子宮內(nèi)膜癌組織中的陽性表達率顯著低于其在正常子宮內(nèi)膜組織中的陽性表達率,分別為25%和100%,P0.01。7.結(jié)合第一部分實驗結(jié)果miR-205在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達,經(jīng)Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌組織中PHLPP2表達與miR-205表達呈負相關(guān)(r=-0.823,P=0.0001)。結(jié)論:1.人子宮內(nèi)膜癌細胞中miR-205的相對表達高于人正常子宮內(nèi)膜上皮細胞;miR-205高表達促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖及侵襲能力,降低其凋亡率。2.miR-205通過直接靶向作用于PHLPP2在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮促癌作用。3.相對于正常子宮內(nèi)膜組織,PHLPP2在子宮內(nèi)膜癌組織中表達顯著下調(diào),子宮內(nèi)膜癌組織中PHLPP2表達與miR-205表達呈負相關(guān)。4.miR-205可能成為子宮內(nèi)膜癌患者分子靶向治療的藥物靶標。本研究的創(chuàng)新點:1.發(fā)現(xiàn)miR-205在子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前診刮術(shù)活檢組織標本中的高表達能夠以較高的準確性預(yù)測術(shù)前診斷為臨床Ⅰ期子宮內(nèi)膜癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風險。當并聯(lián)結(jié)合子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前診刮術(shù)標本中組織分型及分化程度兩項參數(shù)時,預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的準確性進一步提高。為未來進一步優(yōu)化或者更精準地制定Ⅰ期高危子宮內(nèi)膜癌患者的手術(shù)方案提供了新的思路。2.體外實驗證實miR-205在子宮內(nèi)膜癌中發(fā)揮癌基因的作用,并且這種促進子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、侵襲,抑制其凋亡的生物學功能是通過直接靶向作用其靶基因PHLPP2實現(xiàn)的。同時,揭示了 PHLPP2在子宮內(nèi)膜癌中失活的一種表觀遺傳調(diào)控的新機制。3.發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組織中PHLPP2表達與miR-205表達呈負相關(guān),提示二者在子宮內(nèi)膜癌中的關(guān)系。不足及展望:1.miR-205作為一個有希望的子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因子,其預(yù)測價值需要前瞻性、多中心研究的進一步證實。2.有待繼續(xù)深入研究miR-205在子宮內(nèi)膜癌中激活的上游機制以及PHLPP2被miR-205靶向抑制后下游效應(yīng)分子或者信號通路活化的機制及其在子宮內(nèi)膜癌中的作用。3.本研究未實施動物體內(nèi)實驗檢驗miR-205在子宮內(nèi)膜癌異種移植腫瘤中的生物學功能,從而進一步驗證其作為子宮內(nèi)膜癌靶向治療靶標的可能性。有待進一步開展裸鼠體內(nèi)實驗。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

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本文編號：1309725