本文關鍵詞：磷酸二酯酶-4抑制劑ROF通過自噬介導對BV-2細胞NLRP3炎性小體活化的抑制作用

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【摘要】：目的:前期實驗證明,敲低或抑制磷酸二酯酶-4(phosphodiesterase-4,PDE4)能抑制腦內(nèi)炎癥反應,但是機制尚未完全清楚。最近幾年有報道cAMP能誘導自噬,另一方面,研究發(fā)現(xiàn)自噬活動調(diào)控炎癥反應,而抑制自噬能使炎癥反應失控。新型PDE4抑制劑羅氟普蘭(Roflupram,ROF)能提高cAMP水平和抑制炎癥,但是ROF能否能通過提高cAMP水平誘導小膠質(zhì)細胞自噬并通過誘導自噬發(fā)揮抗炎作用仍待探討。方法:(1)使用MTT法檢測不同濃度ROF對正常及活化的BV-2小膠質(zhì)細胞生存率的影響;(2)Western blot檢測自噬相關蛋白、NLRP3炎性小體通路相關蛋白、凋亡相關蛋白、突觸相關蛋白水平的變化;(3)AO、LYT染色標記細胞內(nèi)酸性囊泡;(4)LC3免疫熒光檢測自噬水平變化;(5)使用藥理學自噬抑制劑3-MA及基因組學siRNA ATG7轉(zhuǎn)染抑制自噬;(6)采用CQ檢測自噬潮;(7)ELISA檢測細胞因子;(8)Hoechst染色和相差顯微鏡檢測凋亡N2a細胞及存活細胞突觸變化;(9)條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)系統(tǒng)評價BV-2小膠質(zhì)細胞介導的炎性微環(huán)境對N2a的損害及PDE4抑制劑ROF的保護作用。結果:(1)MTT的結果顯示,ROF在0.625-20μM的濃度范圍內(nèi)不對正常BV-2細胞的活力產(chǎn)生影響,ROF(10 μM)與LPS+ATP及Aβ25-35刺激的BV-2細胞有良好相容性。(2)Western blot結果顯示,與溶劑對照組相比,ROF增加BV-2小膠質(zhì)細胞內(nèi)的LC3-Ⅱ蛋白水平且呈劑量依賴性(2.5-10 μM)和時間依賴性(2-8h),p62的改變與LC3-μ的改變呈負相關;自噬潮檢測顯示,與溶劑對照組相比,CQ(20M)處理后,BV-2細胞LC3-Ⅱ蛋白水平升高,而ROF(5μM)與CQ(20 μM)聯(lián)用后,LC3-Ⅱ蛋白水平顯著升高,比單獨CQ組的LC3-Ⅱ水平更高。另外,ROF在AO及LYT染色中都使BV-2細胞酸性囊泡熒光增加;自噬抑制劑3-MA(1 mM)能逆轉(zhuǎn)ROF的作用。這些結果顯示ROF誘導了 BV-2細胞自噬;雷帕霉素、咯利普蘭和毛喉素在AO和LYT染色中的顯示的變化與ROF相似,提示cAMP信號通路可能參與其自噬的誘導。(3)相差顯微鏡結果顯示,與對照組相比,LPS(1μg/ml)+ATP(1 mM)或Aβ25-35(5 μM)在刺激6 h后明顯激活BV-2小膠質(zhì)細胞,另一方面,Western blot結果顯示,被激活BV-2小膠質(zhì)細胞在功能上發(fā)生相應的改變,包括自噬誘導和NLRP3炎性小體通路活化,表現(xiàn)為自噬標記物LC3-Ⅱ增加和NLRP3炎性小體通路活化相關蛋白IL-1β p17、Caspase-1 p10和NLRP3水平的增加。(4)ELISA結果顯示,與溶劑對照組相比,ROF對細胞釋放IL-1β無明顯影響,但在聯(lián)合LPS+ATP或Aβ25-35處理BV-2細胞后,劑量依賴性減少NLRP3炎性小體通路的細胞因子產(chǎn)物IL-1β的釋放,而且Western blot結果顯示,與LPS+ATP或Aβ25-35組相比,ROF增加活化BV-2細胞LC3-Ⅱ,同時減少其IL-1βp17和Caspase-1 p10,該作用能被自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn),表明ROF誘導活化的BV-2細胞自噬,同時抑制LPS+ATP和Aβ25-35對活化BV-2細胞NLRP3炎性小體通路的激活,該作用與其自噬誘導作用有關;另外,與LPS+ATP和Aβ25-35組相比,ROF與LPS+ATP或Aβ25-35組共培養(yǎng)使BV-2細胞內(nèi)的pro-IL-1β和NLRP3減少,提示ROF的自噬介導的抗炎作用與自噬性降解pro-IL-1β和NLRP3有關。(5)在進一步研究小膠質(zhì)細胞介導的炎癥對神經(jīng)元的毒性作用實驗中,收集不同方法處理的BV-2小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基,用于培養(yǎng)N2a神經(jīng)元細胞24h。Hoechst結合相差顯微鏡結果顯示,LPS+ATP和Aβ25-35處理BV-2細胞的條件培養(yǎng)基增加N2a細胞凋亡和神經(jīng)損傷,ROF在一定程度上能間接改善該損傷,而該作用能被3-MA逆轉(zhuǎn);Western blot檢測進一步驗證了形態(tài)學結果,表現(xiàn)為LPS+ATP和Aβ25-35處理BV-2細胞的條件培養(yǎng)基升高N2a細胞凋亡相關蛋白Caspase-3和突觸相關蛋白PSD95水平,ROF在一定程度上抑制其升高,而該作用能被siRNA ATG7逆轉(zhuǎn),提示ROF自噬介導的抗炎作用能在一定程度上減輕BV-2小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥反應對N2a細胞的毒性。結論:(1)PDE4抑制劑ROF能誘導正常及活化的BV-2小膠質(zhì)細胞自噬,該作用可能與cAMP信號通路有關。(2)NLRP3炎性小體特異性激活劑LPS+ATP和Aβ25-35能激活BV-2細胞及其NLRP3炎性小體通路(刺激6 h),而ROF能減輕它們的激活作用,ROF該作用與其誘導自噬、自噬性降解NLRP3炎性小體成分NLRP3和pro-IL-1 β有關。(3)LPS+ATP和Aβ25-35激活NLRP3炎性小體通路和BV-2細胞介導的神經(jīng)炎癥損傷N2a神經(jīng)元,ROF通過自噬介導抑制BV-2細胞NLRP3炎性小體通路活化的作用,間接減少N2a神經(jīng)元細胞的損傷。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R96

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本文編號：1300513