本文關(guān)鍵詞：CD36對骨骼肌脂肪酸代謝調(diào)控的機制研究

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【摘要】：骨骼肌是胰島素刺激下糖脂代謝的主要外周組織,在維持機體能量平衡中起到了重要的作用。骨骼肌胰島素抵抗是2型糖尿病的重要特征,表現(xiàn)為因過量脂肪酸及其衍生物的堆積導致的骨骼肌對胰島素敏感性的下降。在正常骨骼肌細胞中,脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運及氧化三者處于平衡狀態(tài),使骨骼肌細胞內(nèi)脂肪酸及其衍生物的濃度保持在較低的水平,避免因高濃度脂類積聚對細胞功能造成的損傷。CD36是一種能夠轉(zhuǎn)運長鏈脂肪酸進入骨骼肌細胞的整合膜蛋白。目前對CD36的研究多集中在脂肪酸的轉(zhuǎn)運及攝取方面,對CD36在脂肪酸氧化代謝中的作用及作用機制研究還較少。AMPK作為調(diào)控骨骼肌脂肪酸氧化代謝的關(guān)鍵因素,CD36是否能夠通過激活AMPK對脂肪酸氧化代謝進行調(diào)控,尚不清楚。 目的：本研究描述了CD36-AMPK通路在骨骼肌脂肪酸攝取及氧化過程中的調(diào)控作用。首先利用細胞模型,探討了基礎(chǔ)狀態(tài)下CD36缺乏激活AMPK的作用機制,期望可以為研究CD36對骨骼肌脂肪酸氧化代謝的調(diào)控,提供一個新的思路；另鑒于棕櫚酸代謝對骨骼肌及整個機體能量代謝的重要意義,本研究進一步探討了棕櫚酸作用下CD36激活AMPK的作用機制,期望可以為認識胰島素抵抗等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展提供一些科學參考；最后,通過建立骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平不同的高脂膳食、自主運動及能量限制干預的動物模型,觀察了不同干預方式對CD36總蛋白含量的影響,期望可以為CD36總蛋白含量在小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝的適應性調(diào)控過程中的研究,提供依據(jù)。 方法： 1.基礎(chǔ)狀態(tài)下CD36缺乏對小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝調(diào)控的機制研究 (1)CD36缺乏對AMPK活化水平的影響 1)細胞水平研究CD36對AMPK活化水平的影響：利用siCont或siCD36作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌細胞,用western blot法檢測CD36缺乏對小鼠骨骼肌細胞AMPK磷酸化水平的影響； 2)動物水平研究CD36對AMPK活化水平的影響：以野生型和CD36基因敲除小鼠腓腸肌和心肌組織為研究對象,用western blot法檢測CD36缺乏對小鼠骨骼肌和心肌組織AMPK磷酸化水平的影響。 (2)CD36缺乏激活AMPK的作用機制研究 1)CD36缺乏對LKB1磷酸化水平的影響：以CHO-Vector和CHO-CD36細胞為研究對象,用immunoprecipitation法檢測CD36缺乏對LKB1磷酸化水平的影響。 2)CD36缺乏對LKB1向細胞核轉(zhuǎn)運的影響：用immunofluorescent microscopy法觀測CD36的缺乏對LKB1向細胞核轉(zhuǎn)運的影響。 (3)CD36缺乏對小鼠骨骼肌細胞棕櫚酸氧化水平的影響 1)將siCont或siCD36作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌細胞,用Oxygraph-2k線粒體呼吸儀檢測CD36缺乏對骨骼肌細胞棕櫚酸氧化水平的影響； 2)將siCont或siCD36作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌細胞,用western blot法檢測CD36缺乏對棕櫚酸誘導AMPK/ACC活化水平的影響。 2.棕櫚酸作用下CD36對小鼠骨骼肌脂肪酸代謝調(diào)控的機制研究 (1)棕櫚酸對AMPK活化水平的影響：利用棕櫚酸作用于分化成熟的C2C12小鼠骨骼肌細胞,用western blot法檢測棕櫚酸對小鼠骨骼肌細胞AMPK磷酸化水平的影響。 (2)CD36在棕櫚酸誘導AMPK激活中的作用機制研究：以CHO-CD36細胞為研究對象,經(jīng)過3001μM棕櫚酸作用15分鐘后,用immunofluorescent microscopy法檢測棕櫚酸對LKB1向細胞核轉(zhuǎn)運的影響；用co-immunoprecipitation法檢測CD36與Fyn、LKB1及AMPK的結(jié)合能力。 (3)棕櫚酸對CD36向細胞膜轉(zhuǎn)運的影響：以完全分化的C2C12小鼠骨骼肌細胞為研究對象,經(jīng)過300gM棕櫚酸作用0、5、15、30分鐘后,用In-Cell Western法檢測棕櫚酸對CD36向細胞膜轉(zhuǎn)運的影響；用western blot法檢測棕櫚酸對小鼠骨骼肌細胞AMPK磷酸化水平的影響；用immunoprecipitation法檢測棕櫚酸對被AMPK磷酸化的TBC1D1水平的影響。 3.高脂膳食、運動及能量限制干預下小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平不同對CD36總蛋白含量的影響 清潔級雄性C57小鼠40只,隨機分為四組：對照組(N,n=10)、高脂膳食組(HD,n=10)、自主跑輪運動組(E,n=10)及能量限制組(CR,n=10)。經(jīng)過8周干預后,實驗結(jié)束。小鼠斷頸處死,摘取右側(cè)股四頭肌。 (1)不同干預方式對小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平的影響：用western blot法分別檢測了高脂膳食、自主運動及能量限制對小鼠骨骼肌脂肪酸氧化信號通路AMPK/ACC活化水平的影響。從而建立了小鼠骨骼肌脂肪酸氧化水平不同的動物模型。 (2)小鼠骨骼肌脂肪酸氧化水平不同對CD36總蛋白含量的影響：用western blot法首先檢測了不同干預方式對CD36總蛋白含量的影響,然后進一步檢測了CD36總蛋白含量在不同骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平中的差異。 結(jié)果： (1)與siCont相比,經(jīng)2種siCD36干擾后的C2C12細胞中pAMPK(T172)/AMPK顯著增加(P0.05,P0.01)；與WT小鼠相比,CD36-/小鼠骨骼肌(P0.01)及心肌組織中pAMPK(T172)/AMPK顯著增加(P0.05)。 (2)與CHO-CD36細胞相比,CHO-Vector細胞中LKB1的磷酸化水平有明顯的減少,并且LKB1大量存在于細胞質(zhì)中(P0.05)。與此同時,CHO-Vector細胞中AMPK磷酸化水平整體較高(P0.01)。 (3)棕櫚酸作用于經(jīng)siCont轉(zhuǎn)染的C2C12細胞15分鐘后,AMPK活化水平明顯增加(P0.001),然而棕櫚酸并沒有導致經(jīng)siCD36轉(zhuǎn)染的C2C12細胞AMPK活化水平的進一步增加(P0.05)。 (4)在CHO-CD36細胞中,棕櫚酸能夠明顯抑制LKB1向細胞核的轉(zhuǎn)運。 (5)在CHO-CD36細胞中,棕櫚酸能夠減少CD36與Fyn的結(jié)合能力,同時增加CD36與LKB1及AMPK的結(jié)合能力。 (6)在完全分化的C2C12細胞中,細胞膜CD36的含量隨著棕櫚酸作用時間的延長而增加,其中在棕櫚酸作用30分鐘時,細胞膜CD36的含量有顯著的增加(P0.05)；并且AMPK、TBC1D1磷酸化水平的增加也呈棕櫚酸作用的時間依賴性。 (7)與對照組小鼠相比,經(jīng)過8周高脂膳食干預的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平顯著減少(P0.01),經(jīng)過8周自主運動干預的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平無明顯變化(P0.05),經(jīng)過8周能量限制干預的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平顯著增加(P0.01)；與高脂膳食組小鼠相比,經(jīng)過8周自主跑輪運動及能量限制的小鼠骨骼肌CD36總蛋白表達水平有顯著增加(P0.01)。 結(jié)論： (1)離體、在體實驗均表明,CD36缺乏能夠激活骨骼肌AMPK。其作用機制可能為：CD36缺乏導致了CD36對Fyn的磷酸化水平減少,進一步減少了Fyn對LKB1的磷酸化作用,LKB1磷酸化水平的減少抑制了LKB1向細胞核的轉(zhuǎn)運,從而激活AMPK。 (2)基礎(chǔ)狀態(tài)下CD36的缺乏導致了骨骼肌AMPK/ACC磷酸化水平及脂肪酸氧化水平的增加,然而CD36的缺乏又損傷了棕櫚酸對AMPK激活的敏感性。說明CD36的存在對骨骼肌脂肪酸氧化代謝的調(diào)控起到了重要作用。 (3)當外源性棕櫚酸附著于細胞膜CD36表面時,Fyn與CD36相分離,減少了Fyn對LKB1的磷酸化作用,抑制LKB1向細胞核的轉(zhuǎn)運,從而增加了LKB1對AMPK的激活作用。與此同時,棕櫚酸與CD36的結(jié)合,還可能通過增加CD36與LKB1及CD36與AMPK的結(jié)合能力,在棕櫚酸的作用下形成CD36-LKB1-AMPK復合物,LKB1與AMPK空間距離的靠近,進一步增加了LKB1對AMPK的激活作用。 (4)棕櫚酸可能通過激活骨骼肌AMPK/TBC1D1信號通路,誘導CD36向細胞膜的轉(zhuǎn)運,但無法誘導CD36向線粒體膜的轉(zhuǎn)運。 (5)骨骼肌脂肪酸氧化水平較高的自主運動及能量限制小鼠CD36的總蛋白含量也顯著高于高脂膳食小鼠。該結(jié)果說明了CD36總蛋白含量的變化可能是對不同小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平的一種適應性調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：脂肪酸轉(zhuǎn)移酶 骨骼肌 棕櫚酸 腺苷酸活化蛋白激酶 肝激酶B1 C2C12骨骼肌細胞 自主運動
【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：G804.7
【目錄】：

• 論文摘要6-10
• ABSTRACT10-17
• 第一部分 研究基礎(chǔ)(文獻綜述)17-41
• 前言17-18
• 第一章 CD36與脂肪酸代謝18-26
• 第一節(jié) CD36與脂肪酸攝取18-24
• 第二節(jié) CD36與脂肪酸氧化24-26
• 第二章 CD36與運動26-33
• 第一節(jié) 運動過程中各組織CD36的工作模式26-27
• 第二節(jié) 運動對CD36轉(zhuǎn)運的影響27-28
• 第三節(jié) 骨骼肌CD36的運動適應28-33
• 第三章 CD36與代謝性疾病33-41
• 第一節(jié) CD36與高脂膳食誘導的肥胖及肥胖抵抗33-36
• 第二節(jié) CD36與胰島素抵抗36-38
• 第三節(jié) 其它組織中的CD36與代謝性疾病38-41
• 第二部分 研究報告41-126
• 前言41-42
• 第一章 基礎(chǔ)狀態(tài)下CD36缺乏對骨骼肌脂肪酸氧化代謝調(diào)控的機制研究42-77
• 前言42-43
• 第一節(jié) CD36缺乏對小鼠骨骼肌AMPK激活的影響43-54
• 第二節(jié) CD36缺乏激活AMPK的作用機制研究54-67
• 第三節(jié) CD36缺乏對小鼠骨骼肌細胞脂肪酸氧化代謝的影響67-74
• 本章小結(jié)74-77
• 第二章 棕櫚酸作用下CD36對脂肪酸代謝調(diào)控的機制研究77-105
• 前言77-78
• 第一節(jié) 棕櫚酸對小鼠骨骼肌細胞AMPK激活的影響78-83
• 第二節(jié) CD36在棕櫚酸激活AMPK中的機制研究83-92
• 第三節(jié) 棕櫚酸對CD36向細胞膜轉(zhuǎn)運的影響92-103
• 本章小結(jié)103-105
• 第三章 高脂膳食、運動及能量限制下骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平不同對CD36總蛋白含量的影響105-124
• 前言105-106
• 第一節(jié) 高脂膳食、自主運動及能量限制三種不同干預方式對小鼠骨骼肌脂肪酸氧化代謝水平的影響106-117
• 第二節(jié) 高脂膳食、運動及能量限制三種不同干預方式對CD36總蛋白含量的影響117-124
• 本章小結(jié)124-126
• 第三部分 研究總結(jié)126-131
• 一. 主要結(jié)果與結(jié)論126-127
• 二、研究意義與創(chuàng)新127-129
• 三、主要缺陷與不足129-131
• 附錄131-161
• 參考文獻161-187
• 后記187-188
• 作者簡歷及在讀期間所取得的科研成果188

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