發(fā)布時(shí)間：2017-04-19 21:18

  本文關(guān)鍵詞：基于組學(xué)的奉節(jié)晚橙晚熟變異分子機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：拓寬柑橘成熟時(shí)期是我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)當(dāng)前的迫切需求,延長(zhǎng)鮮果供應(yīng)期,可大力提高我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力。柑橘屬于非躍變型果實(shí),其果實(shí)發(fā)育和成熟調(diào)控機(jī)制依然不清楚,因此研究柑橘果實(shí)成熟分子調(diào)控機(jī)理具有重要的理論和應(yīng)用意義。本研究以‘奉節(jié)72-1’臍橙(Citrus sinensis[L.]Osbeck)及其晚熟突變體‘奉節(jié)晚橙’為研究材料,從轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平和轉(zhuǎn)錄后水平研究了這一對(duì)材料在果實(shí)成熟時(shí)期的差異。主要研究結(jié)果如下:1.‘奉節(jié)72-1’(WT)及其晚熟突變體‘奉節(jié)晚橙’(MT)果實(shí)采收于5個(gè)不同成熟時(shí)期,即150、170、190、210和240 DAF(花后天數(shù),Days after flowering)。本研究測(cè)定了WT和MT在5個(gè)不同成熟時(shí)期果肉脫落酸(ABA)、可溶性糖和有機(jī)酸的含量以及果皮葉綠素含量。通過(guò)對(duì)生理數(shù)據(jù)的比較分析,發(fā)現(xiàn)170 DAF是MT和WT成熟趨勢(shì)發(fā)生差異的起始點(diǎn),因此本研究選擇170、190和210 DAF三個(gè)連續(xù)的發(fā)育時(shí)期作為重點(diǎn)研究對(duì)象,同時(shí)ABA在MT和WT之間的差異可能對(duì)MT晚熟性狀的形成有著重要的作用。2.為了高效和全面的比較分析奉節(jié)72-1和奉節(jié)晚橙在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平的差異,本研究采用RNA-seq技術(shù)比較分析了MT和WT在170、190和210 DAF三個(gè)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異;在蛋白質(zhì)水平上,采用i TRAQ技術(shù)比較分析了MT和WT在這三個(gè)時(shí)期的蛋白質(zhì)豐度差異。在轉(zhuǎn)錄水平,采用P value0.05、FDR≤0.001且差異倍數(shù)大于兩倍的條件篩選到628個(gè)差異表達(dá)基因,其中在170、190和210 DAF三個(gè)時(shí)期分別篩選到352、270和90個(gè)差異基因,三個(gè)時(shí)期中,在MT中下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量大大多于上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量;通過(guò)KEGG代謝通路富集分析,這些差異基因被富集分布于54條不同的代謝通路(每條通路包含3個(gè)以上差異表達(dá)基因),其中在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑富集的差異基因數(shù)量是最多的,在170 DAF達(dá)到16個(gè),其中差異最大是ABA和乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其次還有淀粉與蔗糖代謝途徑、類胡蘿卜素合成代謝途徑等與成熟相關(guān)的路徑上也富集了不少差異基因。在蛋白質(zhì)水平,采用i TRAQ技術(shù)在MT和WT之間鑒定到130個(gè)差異蛋白質(zhì)(1.5倍以上),一些差異蛋白主要參與細(xì)胞壁代謝和檸檬酸代謝,其中還有大量的熱擊蛋白。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的關(guān)聯(lián)分析,發(fā)現(xiàn)大部分transcript-protein點(diǎn)落在無(wú)顯著差異象限,在轉(zhuǎn)錄水平或蛋白質(zhì)水平有差異的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)與蛋白質(zhì)水平表達(dá)的相關(guān)性比較低,甚至有些基因在這兩個(gè)水平出現(xiàn)表達(dá)相反的趨勢(shì),所以這說(shuō)明轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯后水平調(diào)控影響是比較大的,因此綜合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組進(jìn)行系統(tǒng)研究是非常有必要的,這樣可以更加全面和深入的了解分子調(diào)控網(wǎng)路。3.本研究在轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,鑒定出了大量可能參與果實(shí)成熟調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子,一共從MT和WT中鑒定到159個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(TFs),其中52個(gè)TFs在MT和WT之間差異表達(dá),在WT和MT果實(shí)成熟過(guò)程中分別鑒定到92個(gè)和120個(gè)差異表達(dá)TFs,通過(guò)韋恩圖分析,鑒定到在以上三個(gè)TFs集合中都有的16個(gè)TFs。這些轉(zhuǎn)錄因子主要分布于C2H2、Dof、b HLH,、ERF、MYB、NAC和LBD轉(zhuǎn)錄因子家族,其中ERF家族轉(zhuǎn)錄因子在MT和WT之間是差異最多一類轉(zhuǎn)錄因子。通過(guò)WGCNA(加權(quán)關(guān)聯(lián)分析工具)分析,發(fā)現(xiàn)了一些與ABA、檸檬酸、果糖、葡萄糖和蔗糖相關(guān)性非常高的重要TFs,比如RD26、NTT、GATA7和MYB21/62/77等。采用層次聚類分析MT和WT之間差異表達(dá)的52個(gè)TFs,結(jié)合q RT-PCR分析了16個(gè)候選TFs在MT和WT中五個(gè)果實(shí)成熟時(shí)期的表達(dá)情況,進(jìn)一步驗(yàn)證了這些TFs在果實(shí)成熟過(guò)程中的重要性。4.通過(guò)對(duì)MT和WT在170 DAF時(shí)期的small RNAs及降解組的分析,一共鑒定到107個(gè)已知mi RNAs,大部分都在其他物種很保守,此外還鑒定到21個(gè)新的mi RNAs,大部分的新mi RNAs的表達(dá)量并不低,其中在MT和WT之間差異表達(dá)的已知mi RNAs有16個(gè),新mi RNAs有8個(gè)。采用降解組測(cè)序,鑒定出了225個(gè)mi RNAs的靶基因,這些靶基因中SPL類基因和SCL類基因占多數(shù)。靶定SPL基因的mi R156、mi R156k及mi R157a,靶定SCL基因的mi RNAs(csi-mi RN19)以及靶定GAMYB的mi R159都可能是柑橘果實(shí)成熟調(diào)控的關(guān)鍵因子。此外,在本研究中,還鑒定到了66個(gè)PHAS基因以及9個(gè)tasi RNAs,并且一個(gè)tasi RNA可以靶定多個(gè)PHAS基因從而產(chǎn)生大量的phasi RNAs;結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析了mi RNAs表達(dá)水平與其靶基因轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系非常差,結(jié)合后期的靶基因預(yù)測(cè)及PHAS基因的分析,這種關(guān)系的體現(xiàn)是必然的�？偠灾�,mi RNAs在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是非常強(qiáng)大的。
【關(guān)鍵詞】：臍橙 晚熟突變體 果實(shí)成熟 轉(zhuǎn)錄組 蛋白質(zhì)組 small RNA 降解組
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S666.4
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 縮略詞表13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-37
• 1 課題的提出15-16
• 2 果實(shí)成熟調(diào)控研究進(jìn)展16-29
• 2.1 果實(shí)成熟類型16-17
• 2.2 果實(shí)成熟調(diào)控相關(guān)因素17-29
• 3 柑橘芽變發(fā)掘與利用29-31
• 3.1 芽變及其在柑橘中的利用狀況29
• 3.2 柑橘芽變研究進(jìn)展29-30
• 3.3 柑橘熟期突變體的研究進(jìn)展30-31
• 4 果實(shí)成熟分子機(jī)理研究技術(shù)及其在柑橘上的應(yīng)用31-35
• 4.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)31-32
• 4.2 蛋白質(zhì)組學(xué)32-34
• 4.3 Small RNA組和降解組學(xué)34-35
• 5 本研究的目的及內(nèi)容35-37
• 5.1 研究目的和意義35-36
• 5.2 研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線36-37
• 第二章 臍橙晚熟突變體及其野生型轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組分析37-80
• 1 前言37-39
• 2 材料與方法39-48
• 2.1 材料39
• 2.2 方法39-48
• 3 結(jié)果與分析48-73
• 3.1 MT和WT在果實(shí)成熟過(guò)程中可溶性糖、有機(jī)酸和葉綠素的變化48-51
• 3.2 RNA-seq數(shù)據(jù)分析51-64
• 3.3 柑橘果實(shí)成熟過(guò)程中內(nèi)源ABA水平對(duì)ABA、乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控64-67
• 3.4 蛋白質(zhì)組分析67-71
• 3.5 轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組關(guān)聯(lián)分析71-73
• 4 討論73-80
• 4.1 ABA在果實(shí)成熟過(guò)程中的調(diào)控作用75-76
• 4.2 乙烯在果實(shí)成熟過(guò)程中的調(diào)控作用76-77
• 4.3 糖對(duì)果實(shí)成熟的調(diào)控77
• 4.4 細(xì)胞壁代謝途徑在果實(shí)成熟過(guò)程中變化77-78
• 4.5 果實(shí)成熟過(guò)程中其他的調(diào)控因子78-80
• 第三章 柑橘果實(shí)成熟過(guò)程中重要轉(zhuǎn)錄因子的鑒定80-98
• 1 前言80-82
• 2 材料與方法82-83
• 2.1 轉(zhuǎn)錄因子的分離、鑒定和分析82
• 2.2 基因網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建82-83
• 2.3 RNA提取及qRT-PCR分析83
• 3 結(jié)果與分析83-94
• 3.1 果實(shí)成熟過(guò)程中差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子鑒定83-87
• 3.2 采用WGCNA進(jìn)行共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析87-91
• 3.3 MT和WT之間差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子分析91-92
• 3.4 候選轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)分析92-94
• 4 討論94-98
• 第四章 臍橙晚熟突變體及其野生型microRNA及降解組分析98-118
• 1 前言98-100
• 2 材料與方法100-103
• 2.1 材料和RNA提取100
• 2.2 Small RNA和降解組文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序100-101
• 2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析101-102
• 2.4 已知miRNAs和新miRNAs鑒定及差異分析102-103
• 2.5 TasiRNA預(yù)測(cè)103
• 3 結(jié)果與分析103-115
• 3.1 sRNAs測(cè)序及數(shù)據(jù)總結(jié)103-104
• 3.2 降解組測(cè)序及數(shù)據(jù)總結(jié)104-105
• 3.3 MT和WT中已知miRNAs鑒定及表達(dá)分析105-107
• 3.4 MT和WT中新miRNAs鑒定及表達(dá)分析107
• 3.5 已知miRNA及新miRNA靶基因預(yù)測(cè)107-113
• 3.6 PHAS基因及tasiRNAs鑒定113-115
• 4 討論115-118
• 第五章 總討論118-121
• 參考文獻(xiàn)121-142
• 附錄Ⅰ MT和WT之間差異表達(dá)基因集合142-168
• 附錄Ⅱ 在 170、190 和 210 DAF三個(gè)時(shí)期多于3個(gè)在MT和WT之間差異表達(dá)基因的KEGG代謝途徑168-170
• 附錄Ⅲ 在三個(gè)發(fā)育時(shí)期MT和WT中差異表達(dá)蛋白170-176
• 附錄Ⅳ 已知mi RNAs表達(dá)量、序列、pre-miRNA及MT與WT之間差異表達(dá)分析176-181
• 附錄Ⅴ 已知miRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)181-183
• 附錄Ⅵ 新miRNAs二級(jí)結(jié)構(gòu)183-184
• 附錄Ⅶ WT兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)預(yù)測(cè)phasiRNA總結(jié)184-188
• 附錄Ⅷ MT兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)預(yù)測(cè)phasiRNA總結(jié)188-193
• 附錄Ⅸ 攻讀博士期間發(fā)表論文193-195
• 致謝195-197

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本文編號(hào)：317145