本文關鍵詞：凸臍蠕孢菌玉米、高粱專化型的致病分子差異研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：玉米、高粱等禾本科作物大斑病的病原菌為凸臍蠕孢菌(Setosphearia turcica)該菌被劃分為玉米�；�(Setosphearia turcica f. sp. zeae)和高粱專化型(Setosphearia turcica f. sp. sorghi)。凸臍蠕孢菌專化型不侵染彼此的非親和寄主,這種致病�；苑从沉送鼓毴滏呔鷮；椭g的致病差異。目前,尚無關于凸臍蠕孢菌專化型的致病�；瘷C理和遺傳基礎方面的報道。本文對凸臍蠕孢菌�；团c寄主互作的致病性差異的分子機理進行了系統(tǒng)研究,深入分析凸臍蠕孢菌專化型產生致病�；缘南嚓P致病差異基因,對揭示凸臍蠕孢菌專化型的致病�；跃哂兄匾睦碚撘饬x。主要研究結果如下：1.我國玉米、高粱產區(qū)均存在凸臍蠕孢菌玉米專化型和高粱�；�,二者存在嚴格的致病力差異和遺傳多樣性利用形態(tài)學鑒定、ITS鑒定、鑒別寄主致病性測定和UP-PCR分析方法研究凸臍蠕孢菌�；偷蔫b定和遺傳多樣性。結果顯示：(1)凸臍蠕孢菌玉米�；偷牡乩矸植驾^為廣泛,高粱專化型的地理分布受氣候和種植面積的局限,因此,�；偷闹虏；耘c地理分布不存在直接聯系。(2)玉米�；涂梢允褂衩兹~片上形成典型的梭形病斑,在高粱和蘇丹草上僅出現由過敏性壞死反應導致的紫紅色枯死斑。高粱�；驮诟吡缓吞K丹草上均可形成典型病斑,在玉米上無癥狀表現。(3)UP-PCR分析能夠反映出凸臍蠕孢菌�；偷闹虏；院瓦z傳多樣性之間的緊密聯系,不能反映遺傳多樣性與地理分布之間的關系。不同專化型的菌株可被區(qū)分到不同的群組中,同一群組內的菌株均為同一種�；�,這與鑒別寄主交叉致病性試驗和地理分布分析的結果一致。因此,UP-PCR技術可以作為輔助研究凸臍蠕孢菌�；偷挠行侄巍�2.凸臍蠕蠕孢菌�；偷纳飳W表型存在異同利用生物學特性研究方法、生理生化指標測定、RT-PCR驗證等方法對凸臍蠕孢菌專化型生物學表型進行測定比較。結果顯示：(1)不同培養(yǎng)基,氮源,碳源,光照,溫度,pH值,濕度條件下的凸臍蠕孢菌�；偷纳飳W表型表現出異同。(2)凸臍蠕孢菌專化型在附著胞形成、HT-毒素及次生代謝物成分、黑色素合成、細胞壁合成酶、細胞壁降解酶,漆酶,疏水性等生理生化及基因表達方面均存在異同。3.凸臍蠕孢菌�；痛嬖诮换デ秩静町悪C制對凸臍蠕孢菌專化型交互接種的樣本,進行侵染表型比較、光學顯微鏡觀察、掃描電鏡觀察、透射電鏡觀察、毒素生物活性測定及生理生化測定等研究,探討凸臍蠕孢菌�；驮诮M織病理學方面的差異。結果顯示：(1)凸臍蠕孢菌�；蛯τH和寄主能夠正常侵染。(2)凸臍蠕孢菌�；蛯Ψ怯H和寄主表現為可以侵入,但不能擴展顯癥,細胞內觀察顯示病原菌往往局限于葉綠體,造成葉綠體部分解離或不分解,但不影響其生物功能。從寄主細胞結構變化上,植物細胞通常會產生抗性結構,如細胞壁折疊,細胞壁加厚,電子致密物質緊密排列,不定形性結構的出現等來抵御病原菌的侵染。(3)凸臍蠕孢菌專化型的毒素對親和寄主及非親和寄主的致病作用是伴隨在機械損傷的基礎上,對無機械損傷的非親和寄主沒有實質性的致病效果。(4)凸臍蠕孢菌�；颓秩居H和寄主后表現出細胞壁降解酶類隨病程的延長而升高,葉綠素含量下降。侵染非親和寄主后表現出細胞壁降解酶類略有上升,之后隨病程的延長而趨于平穩(wěn),葉綠素含量略有上升或下降的波動,然后小幅上升,之后隨病程的延長而趨于平穩(wěn)。4.凸臍蠕孢菌�；团c寄主互作的轉錄組存在差異采用RNA-seq技術,對接種凸臍蠕孢菌專化型后第48 h的互作樣本進行高通量測序,測序質檢成功后,與凸臍蠕孢菌基因組進行比對,并選取相關致病差異基因進行qRT-PCR驗證及GO富集和KEGG Pathway分析。結果表明：(1)基因的qRT-PCR驗證結果與轉錄組測序結果一致。(2)差異基因的表達量,數量和類群存在異同。StSCK vs StSIN的差異基因總數、上調基因數、下調基因數及特異性差異基因數均少于StZCK vsStZIN。接種48h后,StSCK vs StSIN和StZCK vs StZIN的差異基因分別為1132和2549,特異性表達基因分別為399和1816,共同基因為733。StSCK vs StSIN的差異倍數log2Fold_change≥5的基因為47個,StZCK vs StZIN的差異倍數log2 Fold_change≥2.5的基因為61個。差異基因涉及的致病相關生物進程和功能較為相似,包括水解酶活性、氧化還原酶活性、碳水化合物代謝過程、組氨酸蛋白激酶活性等。(3)GO富集的基因種類和功能的存在差異。StSCK vs StSIN的GO富集包括生物進程、分子功能和細胞成分,GO顯著富集于碳水化合物代謝,細胞壁組織化及其生物合成,水解O-glycosyl化合物和水解酶活性。StZCK vs StZIN的GO富集包括生物進程和分子功能,未出現顯著富集。(4)KEGG Pathway的數量和種類存在差異。StSCK vs StSIN和StZCK vs StZIN的富集Pathway分別為22和35。在StSCK vs StSIN中,與致病相關的富集通路包括過氧物酶體、淀粉和糖代謝、次生代謝產物的生物合成、細胞色素P450、蛋白酶體等。在StZCK vs StZIN中與致病相關的富集通路包括淀粉和糖代謝、次生代謝產物的生物合成、脂肪酸代謝、微生物在不同環(huán)境條件下的代謝、蛋白酶體、谷胱甘肽代謝及MAPK信號途徑—酵母途徑等。5.凸臍蠕孢菌�；偷闹虏∠嚓P基因存在時間表達差異采用qRT-PCR技術監(jiān)測相關致病基因的表達趨勢。結果顯示：(1)水解酶類基因檢測結果顯示,在2種�；椭�,水解酶類基因StsPEL8、StsPEL9、StsBGL5、StzPEL5均體現出較豐富的表達水平,自48 h起,基因開始大幅上調,且基因的表達高峰點上存在差異。說明在病原菌侵染寄主后,水解酶類基因能夠大量表達,即對降解細胞壁的成分均有正調控作用,輔助菌絲的擴展,有利于病程的發(fā)展。(2)氧化還原酶類基因檢測結果顯示：在2種�；椭�,氧化還原酶類基因均體現出較豐富的表達水平,但各基因的表達規(guī)律存在差異。其中高粱�；椭蠸tsCRAT、StsACOH、StsXDH基因均為上調表達,且隨著病程延長,表達量繼續(xù)上升,StsHMGCL基因在36 h和48 h略有下調,隨著病程延長,表達量上升,基因上調。玉米�；椭蠸tzPOD2基因顯著上調為6-72 h,96-120 h出現下調。StzHMGCL基因在48 h略有下調,且隨著病程延長,表達量繼續(xù)上升。(3)蛋白激酶類及生長發(fā)育調節(jié)的基因表達檢測顯示：在2種專化型中,此類基因均體現出較豐富的表達水平,但各基因的表達規(guī)律存在差異。在高粱專化型中的StsPDE12、StsPKC13、StsPKC17基因隨病程延長,出現顯著上調表達。在玉米專化型中的StzSte20基因僅在6 h上調表達,StzRhol和StzHogl基因在48 h出現下調,隨病程延長,出現顯著上調表達。StzGlol、StzHsp72和StzPKC15均為上調表達。6.凸臍蠕孢菌�；椭虏〔町惢虻墓δ茴A測利用轉錄組測序結果,選取致病差異基因的開放閱讀框設計特異性引物進行DNA和48h互作樣品cDNA的克隆分析和功能預測。結果顯示：轉錄組結果與克隆結果一致。(1)凸臍蠕孢菌專化型的DNA克隆說明了StsACOXl基因和StzCypl基因存在于2種�；途甑幕蚪M上,但cDNA克隆體現了兩種基因對親和寄主的特異性表達,在非寄主上沒有表達。推測兩種基因可能是引起凸臍蠕孢菌�；椭虏；缘牟町惢�。(2)StsACOXl基因編碼368個氨基酸,分子量為43.3kD,理論等電點(pI)為9.88,分子式為C1892H2830N598O527S25。該蛋白沒有跨膜域和信號肽,即未在生物膜上定位,不是信號蛋白,推測其常規(guī)調控胞內蛋白,屬于ANK基因家族。StsACOX1蛋白與凸臍蠕孢菌的同源性最高,且具有進化特異性。StsACOX1基因的時間表達均為上調,但時高時低,72 h的表達量達到高峰。(3)StzCyp1基因編碼501個氨基酸,分子量為55.8 kD,理論等電點(pI)為9.24,分子式為C2451H3916N694O725S34,該蛋白沒有跨膜域和信號肽,即未定位在生物膜上,不屬于信號蛋白,可能直接調控胞內蛋白,屬于細胞色素450基因家族。StzCyp1蛋白與凸臍蠕孢菌、平臍蠕孢菌及離蠕孢菌的同源性高達100%,推測其不具有進化特異性。StzCyp1基因的時間表達均為上調,但時高時低,120 h的表達量達到高峰。
【關鍵詞】：凸臍蠕孢菌 專化型 UP-PCR 生物表型 組織病理學 轉錄組 qRT-PCR 克隆
【學位授予單位】：沈陽農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4
【目錄】：

• 摘要14-18
• ABSTRACT18-21
• 前言21-22
• 第一章 凸臍蠕孢菌(Setosphearia turcica)及其致病分子差異機理研究進展22-33
• 1.1 玉米大斑病和高粱大斑病的概況22-23
• 1.1.1 病原菌22
• 1.1.2 玉米大斑病的發(fā)生與危害22
• 1.1.3 高粱大斑病的發(fā)生與危害22-23
• 1.2 凸臍蠕孢菌(Setosphearia turcica)生理分化研究進展23-25
• 1.2.1 凸臍蠕孢菌�；偷难芯窟M展23
• 1.2.2 凸臍蠕孢菌生理小種的研究進展23-25
• 1.3 凸臍蠕孢菌分子水平的致病因子研究進展25-29
• 1.3.1 信號轉導途徑類25
• 1.3.2 細胞壁降解酶類(CWDE)和細胞內物質降解酶類25-26
• 1.3.3 毒素26
• 1.3.4 黑色素26-27
• 1.3.5 氧化還原類27-29
• 1.4 致病差異分子機理研究技術的研究進展29-32
• 1.4.1 同工酶可溶性蛋白電泳技術29-30
• 1.4.2 RAPD技術30
• 1.4.3 SSR技術30
• 1.4.4 ISSR技術30
• 1.4.5 AFLP技術30
• 1.4.6 UP-PCR技術30-31
• 1.4.7 DDRT-PCR技術31
• 1.4.8 SSH技術31
• 1.4.9 實時熒光PCR技術31
• 1.4.10 轉錄組研究技術31-32
• 1.4.11 蛋白質組研究技術32
• 1.5 本研究的目的和意義32-33
• 第二章 凸臍蠕孢菌專化型的鑒定及遺傳多樣性研究33-54
• 2.1 材料與方法33-37
• 2.1.1 試驗材料33-34
• 2.1.2 供試儀器及設備34
• 2.1.3 試驗方法34-37
• 2.2 結果與分析37-53
• 2.2.1 形態(tài)學特征觀察37
• 2.2.2 ITS鑒定37-40
• 2.2.3 �；丸b定、致病性測定及感病高粱的篩選40-50
• 2.2.4 UP-PCR遺傳多樣性分析50-53
• 2.3 小結53-54
• 第三章 凸臍蠕孢菌�；偷纳飳W表型比較54-90
• 3.1 材料與方法54-61
• 3.1.1 試驗材料54
• 3.1.2 供試儀器及設備54
• 3.1.3 試驗方法54-61
• 3.2 結果與分析61-88
• 3.2.1 不同培養(yǎng)基上的生物表型的比較61-64
• 3.2.2 不同碳源、氮源條件下生物表型的比較64-70
• 3.2.3 不同環(huán)境因子條件下生物表型的比較70-75
• 3.2.4 附著胞形成及侵染能力的顯微觀察75-77
• 3.2.5 細胞壁降解酶活性的比較77
• 3.2.6 耐受外源滲透脅迫能力的比較77-80
• 3.2.7 疏水性比較80
• 3.2.8 細胞壁合成酶相關基因的表達量比較80-81
• 3.2.9 HT-毒素表型比較81-84
• 3.2.10 黑色素表型比較84-85
• 3.2.11 漆酶表型比較85-87
• 3.2.12 降解木質素能力的比較87-88
• 3.3 小結88-90
• 第四章 凸臍蠕孢菌�；偷慕M織病理學表型比較90-114
• 4.1 材料與方法90-94
• 4.1.1 試驗材料90
• 4.1.2 供試儀器及設備90
• 4.1.3 試驗方法90-94
• 4.2 結果與分析94-113
• 4.2.1 交叉侵染的表型比較94-95
• 4.2.2 交叉侵染的光學顯微鏡觀察比較95-97
• 4.2.3 交叉侵染的掃描電鏡觀察比較97-98
• 4.2.4 交叉侵染的透射電鏡觀察比較98-106
• 4.2.5 交叉侵染的毒素生物活性比較106-108
• 4.2.6 交叉侵染的生理生化特性比較108-113
• 4.3 小結113-114
• 第五章 凸臍蠕孢菌�；团c寄主互作的轉錄組研究114-139
• 5.1 材料與方法114-119
• 5.1.1 試驗材料114
• 5.1.2 供試儀器及設備114
• 5.1.3 試驗方法114-119
• 5.2 結果與分析119-138
• 5.2.1 RNA質檢分析119-120
• 5.2.2 測序結果的質量評估120-121
• 5.2.3 qRT-PCR驗證121-122
• 5.2.4 差異表達基因分析122-131
• 5.2.5 差異基因GO富集分析131-134
• 5.2.6 差異基因KEGG Pathway分析134-138
• 5.3 小結138-139
• 第六章 凸臍蠕孢菌專化型在互作過程中的相關差異基因表達量檢測139-162
• 6.1 材料與方法139-140
• 6.1.1 試驗材料139
• 6.1.2 供試儀器及設備139
• 6.1.3 試驗方法139-140
• 6.2 結果與分析140-160
• 6.2.1 高粱�；团c寄主互作的相關差異基因的表達量檢測140-150
• 6.2.2 玉米專化型與寄主互作的相關差異基因的表達量檢測150-160
• 6.3 小結160-162
• 第七章 凸臍蠕孢菌�；椭虏∠嚓P基因的克隆與表達分析162-188
• 7.1 材料與方法162-166
• 7.1.1 試驗材料162
• 7.1.2 供試儀器及設備162-163
• 7.1.3 試驗方法163-166
• 7.2 結果與分析166-186
• 7.2.1 StsACOX1基因的克隆及生物信息學分析166-175
• 7.2.2 StzCyp1基因的克隆及生物信息學分析175-185
• 7.2.3 qRT-PCR185-186
• 7.3 小結186-188
• 第八章 結論與討論188-201
• 8.1 凸臍蠕孢菌專化型的致病�；耘c遺傳多樣性存在相關性188-189
• 8.2 凸臍蠕孢菌�；偷纳飳W表型存在異同189-192
• 8.3 凸臍蠕孢菌�；痛嬖诮换デ秩静町悪C制192-193
• 8.4 凸臍蠕孢菌專化型與寄主互作的轉錄組存在差異193-196
• 8.5 凸臍蠕孢菌�；偷闹虏∠嚓P基因存在時間表達差異196-199
• 8.6 凸臍蠕孢菌專化型存在特異性表達的差異致病相關基因199-200
• 8.7 存在的問題和展望200-201
• 參考文獻201-212
• 致謝212-214
• 攻讀博士學位期間發(fā)表學術論文214-215
• 論文圖表統(tǒng)計215

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 馮晶,高增貴,薛春生,莊敬華,陳捷,白淑英;玉米彎孢霉葉斑病菌產生的細胞壁降解酶的致病作用研究[J];雜糧作物;2002年03期

2 曹志艷;藏金萍;賈慧;李旭光;王平;;玉米大斑病菌漆酶活性測定及基因片段的克隆[J];華北農學報;2011年02期

3 許華夏,李培軍,劉宛,宋玉芳;生物細胞色素P450的研究進展[J];農業(yè)環(huán)境保護;2002年02期

4 任彭;劉兆平;;細胞色素P450研究概況及其應用[J];食品與藥品;2006年10期

5 李欣;李紅玉;;病原中的活性氧釋放研究進展[J];生態(tài)學報;2006年07期

6 張敏,肖亞中,蒲春雷,趙萍,王軍,吳涓,王怡平;白腐真菌AH28-2菌株發(fā)酵合成漆酶初步研究[J];微生物學通報;2002年03期

7 劉艷梅;韓建民;董金皋;;玉米大斑病菌鈣調磷酸酶B亞基基因的克隆與生物信息學分析[J];微生物學報;2008年09期

8 王教瑜;吳小燕;杜新法;柴榮耀;孫國昌;;植物病原真菌過氧化物酶體的發(fā)生機制及功能[J];微生物學報;2008年12期

9 孫淑琴;溫雷蕾;董金皋;;玉米大斑病菌的生理小種及交配型測定[J];玉米科學;2005年04期

10 高金欣;呂淑霞;高增貴;莊敬華;張小飛;張碩;;東北地區(qū)2009年玉米大斑病菌生理小種鑒定與動態(tài)分析[J];玉米科學;2011年03期

中國重要會議論文全文數據庫 前2條

1 賈慧;曹志艷;董金皋;;玉米大斑病菌黑色素合成調控基因StMR1的克隆及生物信息學分析[A];中國植物病理學會2012年學術年會論文集[C];2012年

2 李志勇;白輝;朱彥彬;全建章;董金皋;董志平;;谷子十里香與銹菌非親和互作轉錄組測序分析[A];中國植物病理學會2012年學術年會論文集[C];2012年

中國博士學位論文全文數據庫 前7條

1 申貴;大豆疫霉侵染大豆早期差異表達基因的篩選與功能分析[D];南京農業(yè)大學;2005年

2 李成偉;番茄與白粉菌互作的細胞學和轉錄組學分析[D];中國農業(yè)科學院;2007年

3 谷守芹;調控玉米大斑病菌生長發(fā)育和致病性的STK基因的克隆與功能分析[D];河北農業(yè)大學;2007年

4 郝志敏;玉米大斑病菌G蛋白和磷脂酶C基因的克隆與功能分析[D];河北農業(yè)大學;2008年

5 李曉艷;越橘果實轉錄組文庫Solexa測序及花色素苷合成相關基因的表達分析[D];吉林農業(yè)大學;2012年

6 趙艷琴;煙草靶斑病菌（Rhizoctonia solani AG-3）遺傳多樣性、定量檢測技術及轉錄組學分析[D];沈陽農業(yè)大學;2013年

7 柯希望;黑腐皮殼侵染蘋果的組織細胞學及轉錄組學研究[D];西北農林科技大學;2013年

中國碩士學位論文全文數據庫 前6條

1 張韶茹;StRas2基因調控玉米大斑病菌致病性的機制研究[D];河北農業(yè)大學;2012年

2 王梅娟;玉米大斑病菌CWI-MAPK級聯途徑中StBCK1基因功能的研究[D];河北農業(yè)大學;2012年

3 王妍;玉米大斑病菌信號轉導途徑中ras基因的克隆與功能研究[D];河北農業(yè)大學;2009年

4 王曉莉;大豆疫霉轉錄組研究及GPR功能分析[D];南京農業(yè)大學;2009年

5 何玉蓮;玉米大斑病菌St3HNR與St4HNR間功能互補關系研究[D];河北農業(yè)大學;2014年

6 張曉玉;水甘油通道蛋白基因StFPS1對玉米大斑病菌生長發(fā)育及侵染能力的影響[D];河北農業(yè)大學;2014年

  本文關鍵詞：凸臍蠕孢菌玉米、高粱�；偷闹虏》肿硬町愌芯�，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：290990