本文關(guān)鍵詞： 新城疫病毒 血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白 納米抗體 酵母雙雜交　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種嚴(yán)重危害雞和多種禽類的急性高度接觸性傳染病。自1926年首次報道以來,ND在全球范圍內(nèi)已發(fā)生四次大流行,給各國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失,同時也嚴(yán)重威脅著野生鳥類健康,是影響?zhàn)B禽業(yè)最主要疫病之一,被國際獸醫(yī)局(Office International Des Epizooties,OIE)列為必須通報的動物疫病。過去幾十年,由于世界各國采取了嚴(yán)格的疫苗免疫措施,使ND的大規(guī)模流行得到了有效控制,然而免疫雞群發(fā)生ND的情況仍然存在,并且不斷從免疫雞群中分離到致病性NDV,同時研究表明現(xiàn)有疫苗和治療性生物制品并不能完全阻止ND的傳播,因此很有必要嘗試開發(fā)新的產(chǎn)品以用于ND的防控。20世紀(jì)90年代后期,Hamers等在駱駝科和鯊魚科動物體內(nèi)首次報道了重鏈抗體的存在,克隆其具有抗原結(jié)合能力的可變區(qū)后即為VHH(Variable domain of camelid heavy-chain antibody)。由于VHH為單域結(jié)構(gòu),分子量僅為常規(guī)抗體的1/10,且大小在納米級,因此又被稱為納米抗體(Nanobody,Nb)。分析重鏈抗體重鏈可變區(qū)后發(fā)現(xiàn),相比常規(guī)抗體而言,VHH抗體FR2區(qū)(Framework regions,FR)37、44、45和47位發(fā)生親水性氨基酸替換,CDR1(Complement determine region,CDR)和CDR3區(qū)存在額外半胱氨酸殘基,且CDR3區(qū)較常規(guī)抗體CDR3區(qū)要長。上述結(jié)構(gòu)特點使納米抗體具有分子量小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、親和力高、不易聚集、可識別常規(guī)抗體不能識別的結(jié)構(gòu)和一些隱蔽表位等優(yōu)點。因此,納米抗體是病毒性疾病診斷和治療的理想分子,但目前尚未見有關(guān)抗NDV納米抗體的報道。本研究為了獲得抗NDV的納米抗體,首先構(gòu)建了NDV免疫納米抗體酵母雙雜交文庫,并對文庫質(zhì)量進行了評價;以截短的NDV HN蛋白為靶標(biāo),構(gòu)建p GBKT7-HN誘餌質(zhì)粒,對納米抗體酵母雙雜交文庫進行篩選,并將篩選出的納米抗體表達(dá)純化后進行活性鑒定;同時構(gòu)建了二聚化納米抗體,比較了二聚化納米抗體和單體納米抗體的反應(yīng)活性;最后構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)納米抗體的DF-1細(xì)胞系,探究了穩(wěn)定表達(dá)納米抗體對NDV增殖的影響。主要內(nèi)容如下:(1)利用新城疫(La Sota株)和H9禽流感(F株)二聯(lián)滅活疫苗參照駱駝與成年雞體重比對6月齡雌性雙峰駝進行5次免疫,免疫后通過HI試驗監(jiān)測雙峰駝體液免疫應(yīng)答水平,當(dāng)抗體水平最高時采集外周血,分離外周血淋巴細(xì)胞。以分離的外周血淋巴細(xì)胞為起始材料,抽提總RNA,通過巢式PCR擴增編碼VHH的基因序列。將帶有同源臂的VHH PCR產(chǎn)物與線性化的p GADT7-Rec質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞,通過在酵母細(xì)胞內(nèi)同源重組來構(gòu)建納米抗體酵母雙雜交文庫。經(jīng)測定,構(gòu)建的文庫庫容為1.25×107,滴度為3.45×108cfu/m L,文庫插入效率為96%;隨機挑取10個PCR陽性的克隆做測序比對,結(jié)果顯示均為VHH抗體序列,且序列各不相同,表明文庫多樣性良好。(2)以NDV HN蛋白編碼基因為模板,PCR擴增得到截掉跨膜區(qū)的HN基因序列(49-577位氨基酸),克隆至p GBKT7載體上構(gòu)建誘餌質(zhì)粒p GBKT7-HN。誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞后,進行自激活能力和毒性驗證,結(jié)果表明此誘餌菌無自激活活性和毒性。以此誘餌菌與文庫菌進行雜交來篩選抗HN蛋白的納米抗體,篩選到的陽性克隆進行文庫質(zhì)粒拯救,拯救的陽性質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞進行確證,最后對確認(rèn)的真陽性質(zhì)粒進行序列測定和比對分析,最終成功獲得7株陽性克隆。(3)將獲得的7株抗體序列克隆至原核表達(dá)載體p HSIE上,構(gòu)建納米抗體原核表達(dá)質(zhì)粒p HSIE-VHH;轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞進行誘導(dǎo)表達(dá),并優(yōu)化表達(dá)條件,發(fā)現(xiàn)納米抗體在IPTG濃度為0.4 mmol/L,誘導(dǎo)6 h時表達(dá)量最佳;按照優(yōu)化的最佳表達(dá)條件進行大量誘導(dǎo)表達(dá)后,參照Clontech公司的Talon Metal Affinity Resin樹脂說明書純化重組蛋白,并優(yōu)化了純化時的洗脫條件,獲得了雜帶少、條帶單一的VHH抗體。同時為鑒定純化的VHH抗體與NDV和HN蛋白的反應(yīng)活性,本研究進行了血凝抑制試驗(Haemagglutination inhibition assay,HI)、間接ELISA、斑點雜交、Pull down、免疫細(xì)胞化學(xué)試驗和細(xì)胞中和試驗。HI試驗結(jié)果顯示,7株VHH抗體可不同程度抑制多種NDV毒株的血凝活性,但HI滴度均顯著低于陽性血清對照(P0.05)。間接ELISA結(jié)果表明,VHH抗體均可與NDV反應(yīng),其OD450值顯著高于陰性對照(P0.05),且VHH3、VHH4、VHH5、VHH6和VHH7的反應(yīng)性高于陽性對照。斑點雜交結(jié)果顯示,VHH抗體可識別非變性的NDV病毒粒子。Pull down試驗進一步證明VHH抗體可與HN蛋白反應(yīng)。細(xì)胞免疫化學(xué)試驗結(jié)果顯示,VHH抗體還可識別被病毒感染的DF-1細(xì)胞內(nèi)的NDV抗原。最后,細(xì)胞中和試驗發(fā)現(xiàn)部分VHH抗體可在感染早期干擾病毒的復(fù)制。(4)為改善VHH抗體的反應(yīng)性和中和活性,利用一段linker通過Overlap PCR將2個VHH單體進行串聯(lián)后克隆至表達(dá)載體p HSIE上,構(gòu)建了二聚化VHH抗體表達(dá)載體p HSIE-Dim VHH。將p HSIE-Dim VHH轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞后,進行了二聚化抗體的誘導(dǎo)表達(dá),并優(yōu)化了表達(dá)條件,結(jié)果發(fā)現(xiàn)二聚化VHH抗體在IPTG終濃度為0.4mmol/L,誘導(dǎo)12 h后表達(dá)量最佳。根據(jù)Talon樹脂(Clontech)操作說明純化了二聚化VHH抗體,并優(yōu)化了純化條件,最終獲得了較純的二聚化VHH抗體。間接ELISA和中和試驗結(jié)果顯示,二聚化VHH抗體的ELISA反應(yīng)活性高于單價VHH抗體,但中和活性并無改善。(5)為了探究VHH抗體在細(xì)胞內(nèi)的抗病毒活性,本章構(gòu)建了納米抗體慢病毒表達(dá)載體,與包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,拯救出了慢病毒,再通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式將VHH抗體導(dǎo)入DF-1細(xì)胞中,經(jīng)過嘌呤霉素篩選后獲得了穩(wěn)定表達(dá)VHH抗體的細(xì)胞系,并在穩(wěn)定表達(dá)VHH的細(xì)胞系對NDV增殖情況進行了探究,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)VHH的可抑制NDV的增殖。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1554003