本文關鍵詞： 青蝦 家系構建 生長特性 小RNA 蛋白質組學 關聯(lián)分析 生長調控網絡　出處：《山東農業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：青蝦是長臂蝦科中有重要經濟價值的品種,其天然產量低,人工繁育難度很大,水產養(yǎng)殖中常缺乏規(guī)格整齊的優(yōu)質速生青蝦苗。不能規(guī)模化繁殖苗種供應市場需求成為青蝦人工養(yǎng)殖的限制因素之一,而傳統(tǒng)采用捕撈已抱卵野生雌蝦在土塘中自然繁殖的育苗方式,獲得的蝦苗品質和產量較低。為了標準化培育優(yōu)質青蝦苗,進一步提高青蝦產量,深入研究其調控生長的分子機理,本研究從青蝦生長特性入手,以構建的全同胞家系為實驗材料,排除生長過程中環(huán)境因素對生長產生的影響,從組織學角度、核酸水平的轉錄組學及小RNA組學,進而從蛋白水平的蛋白質組質譜分析,最后將各組學進行聯(lián)合分析,由表及里的逐層對生長差異進行分析,挖掘生長相關miRNA,最終獲得青蝦生長相關的主要調控網絡,為進一步培育青蝦高產速生新品系提供參考。主要研究內容和結果如下:(1)采用在水族箱中模擬青蝦全人工繁育的仿生態(tài)系統(tǒng),成功構建了全同胞家系,為室內標準化育苗構建青蝦家系用于后續(xù)的選擇育種提供了技術參考。(2)發(fā)現(xiàn)了與青蝦具親緣關系的長臂蝦科一個未命名新種,暫定名為彌河蝦,并對其家系構建進行了初步研究,結果表明,彌河蝦具備優(yōu)良生長特性,有望成為青蝦雜交改良的親本之一。選用70日齡的相同飼養(yǎng)條件下,且處于蛻殼間期的青蝦全同胞家系,以體長差異分為2組,FG組為生長快速者,SG組為生長慢速者,進行如下研究:(3)組織學研究:以成年雄蝦和抱卵雌蝦的肝胰腺做參照,肝胰腺石蠟切片結果表明,FG組的肝胰腺細胞比SG組分化更快更完善,而SG組結締組織和胚性細胞較多,反映出兩組在營養(yǎng)攝入及消化效率中的差異,推測FG組代謝更旺盛;同時,腹部肌肉的石蠟切片結果表明,FG組腹部肌肉橫切面的肌纖維直徑各參數(shù)均比SG組長,表明FG組的腹部肌肉生長速度更快。(4)轉錄組研究:以整只蝦提取總RNA,進行基于High-seq 4000平臺的無參考基因組轉錄組測序以及基于High-seq 2500平臺的小RNA測序,對差異表達基因與差異miRNA分別進行篩選、GO富集及KEGG通路分析,預測了DEM的靶基因,并對差異表達基因DEG與差異表達小RNA即DEM進行關聯(lián)分析,進而采用q RT-PCR方法對差異表達基因與miRNA相對表達量進行了驗證。(1)無參考基因組轉錄組測序:FG組獲得22792166條clean reads,占總reads 97.33%;SG組獲得22534835條clean reads,占總reads 97.32%。在FG組與SG組中,共檢測到2739個基因顯著差異表達。以SG組為參照,FG組中有2116個基因表達顯著上調,有623個基因表達顯著下調。選取15個差異表達基因對高通量測序結果進行q RT-PCR驗證,結果與轉錄組測序結果基本一致,兩者具有很強的相關性(R2=0.901)。(2)小RNA測序:在兩組中共檢測到592個差異表達的miRNA(含新發(fā)現(xiàn)的miRNA),其中有457個miRNA在兩個樣品中共同表達,有68個僅在FG組中表達,有67個僅在SG組中表達。另外,發(fā)現(xiàn)了84個差異表達的新miRNA,有15個新miRNA僅在FG組中表達,有18個新miRNA僅在SG組中表達。選取11個miRNA進行q RT-PCR驗證,結果與高通量測序結果基本一致,相關系數(shù)為R2=0.972。(3)轉錄組與小RNA測序的關聯(lián)分析:關聯(lián)到14個主要的差異miRNA(上調表達5個、下調表達9個,包含2個全新的miRNA序列novel_22和novel_51),5個上調miRNA對45個下調差異表達基因具有調控作用,9個下調miRNA對137個上調差異表達基因具有調控作用。(5)蛋白組研究:為了從蛋白水平檢驗基因的轉錄后表達差異,取用同家系同批次青蝦,采用Velos Pro離子阱與高場Orbitrap技術相結合的Thermo Scientific Orbitrap Elite組合式質譜儀,對FG組與SG組的總蛋白酶解肽段,做質譜分析,質譜信息以轉錄組測序數(shù)據預測出的氨基酸庫為比對庫進行搜庫注釋,以Max fold change≥2與Anova p-value≤0.05為限制篩選條件,篩選到生長快速組有8個蛋白表達比慢速組顯著升高,有104個蛋白表達比慢速組顯著降低。轉錄組、小RNA與蛋白質組的聯(lián)合分析,獲得了調控青蝦生長的3條調控網絡。聯(lián)合分析結果表明:青蝦全同胞家系的生長差異是由于快慢兩組間基因轉錄效率的差異以及由酶類催化的代謝差異造成的,該過程受相關miRNA的調控。獲得的3條青蝦生長相關基因調控網絡模式為:網絡模式1:由sha-miR-21調控靶基因CFL,作用于肌動蛋白解聚因子(cofilin/actin-depolymerizing factor)的表達,推測其在青蝦肌肉發(fā)育中起正調控作用。網絡模式2:由sha-miR-21和hsa-miR-21-5p共同調控靶基因MCCC1的同源基因,影響β-甲基丁烯酰輔酶A羧化酶(methylcrotonoyl-Co A carboxylase)的表達,調控纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解途徑,推測其在青蝦生長中對氨基酸的利用速率中起主要的正調控作用,促進青蝦生長。網絡模式3:由新的miRNA成員novel_22調控靶基因Tspst的同源基因,作用于蛋白酶體β7亞基(proteasome subunit beta type-7),調控泛素蛋白酶體途徑,推測其在青蝦生長中對蛋白降解速率起主要調控作用,其蛋白表達下調時,利于同化作用,正調控青蝦生長。sha-miR-21同時調控網絡模式1和網絡模式2,形成由氨基酸代謝關聯(lián)肌肉生長的網絡,在全同胞家系的生長中起重要作用。總之,本研究成功構建了青蝦全同胞家系,從組織學角度及m RNA、miRNA和蛋白質組學角度,系統(tǒng)研究了排除環(huán)境影響后,青蝦全同胞家系生長差異的分子生物學機理,獲得了3條調控青蝦生長的網絡,為培育青蝦速生家系提供重要參考。
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【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

【參考文獻】

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本文編號：1553559