本文關(guān)鍵詞： 大腸桿菌O157:H7 土壤顆粒 粘土礦物 粘附 代謝活性 存活 生物被膜 毒性　出處：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：全球每年約產(chǎn)生1010t 1011t畜禽糞便,而畜禽糞便中含有大量的病原微生物。若未經(jīng)有效處理,就直接作為糞肥或土壤改良劑施入到農(nóng)田,會(huì)導(dǎo)致土壤生物污染,進(jìn)而引發(fā)人畜共患病的傳播、感染及暴發(fā)。腸出血性大腸桿菌O157:H7是常見(jiàn)的人畜共患病原菌,因其感染劑量低(10個(gè)活細(xì)胞),并發(fā)癥嚴(yán)重(溶血性尿毒癥),而備受關(guān)注。該病原菌主要通過(guò)畜禽糞便進(jìn)入土壤環(huán)境,可在土壤中存活1年以上,易感染環(huán)境中的動(dòng)物;而感染的動(dòng)物又會(huì)重新產(chǎn)生并釋放病原菌,周而復(fù)始,導(dǎo)致惡性循環(huán)。此外,土壤中的大腸桿菌O157:H7可發(fā)生遷移,不僅會(huì)污染地表水和地下水,也會(huì)污染土壤中種植的蔬菜瓜果等農(nóng)產(chǎn)品,嚴(yán)重威脅人類健康和公共安全。近30年來(lái),全球共暴發(fā)上百次大腸桿菌O157:H7感染性腹瀉事件。其中,免疫功能不全的兒童或老人備受威脅,感染病原菌后的死亡率可高達(dá)15%。因此,本文以大腸桿菌O157:H7和多種土壤組分(不同類型土壤、不同粒徑土壤顆粒、粘土礦物)為材料,采用土壤化學(xué)和分子生物學(xué)方法,如土壤基本性質(zhì)的表征,等溫平衡粘附,細(xì)胞平板計(jì)數(shù),結(jié)晶紫染色法,定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)法等;借助掃描電子顯微鏡、原子力顯微鏡、熒光顯微鏡等現(xiàn)代分析儀器,探究大腸桿菌O157:H7與土壤組分的界面互作和存活機(jī)制,以阻控由病原菌引起的土壤生物污染。主要研究結(jié)果如下:(1)闡明了土壤理化性質(zhì)和大腸桿菌O157:H7粘附行為的相關(guān)性及貢獻(xiàn)程度。一元線性回歸分析表明,大腸桿菌O157:H7的平衡分配系數(shù)(Kd)與土壤有機(jī)質(zhì)的含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P0.01),而土壤pH、電導(dǎo)率、粘粒含量、比表面積、陽(yáng)離子交換量(CEC)和Kd無(wú)顯著相關(guān)(P0.05)。偏相關(guān)分析排除其它因素的干擾,發(fā)現(xiàn)土壤有機(jī)質(zhì)和粘粒共同控制大腸桿菌O157:H7的粘附行為(P0.05)。通過(guò)多元逐步回歸手段,得到Kd和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性方程:Kd=-1.306×OM+0.536×CC+51.036(P0.01),表明有機(jī)質(zhì)是最重要的影響因素,對(duì)病原菌粘附的貢獻(xiàn)率為66.95%,顯著高于粘粒(33.05%)。因此,土壤有機(jī)質(zhì)和粘粒等固相性質(zhì)調(diào)控大腸桿菌O157:H7的粘附行為,最終影響病原菌在環(huán)境中的遷移和分布。(2)探明了土壤類型(紅壤/棕壤),顆粒大小(砂粒、粉粒和粘粒),氧(氫氧)化鐵/鋁,有機(jī)質(zhì)對(duì)大腸桿菌O157:H7在土壤環(huán)境中存活的影響機(jī)制。大腸桿菌O157:H7接種于棕壤顆粒中,3d內(nèi),病原菌的數(shù)量上升0.6 log10CFU/g 1.4 log10 CFU/g(除去有機(jī)質(zhì)粘粒外)。而紅壤顆粒中的大腸桿菌O157:H7數(shù)量快速下降,直到檢測(cè)下線;初始6h的失活速率最高,病原菌的數(shù)量下降0.52log10 CFU/g 0.97 log10 CFU/g。去除氧(氫氧)化鐵/鋁后,紅壤顆粒的殺菌性能降低,大腸桿菌O157:H7的存活能力顯著提高。對(duì)兩種土壤而言,大腸桿菌O157:H7均在含有機(jī)質(zhì)粘粒中的存活能力最強(qiáng)。相比于砂粒和粉粒,粘粒對(duì)大腸桿菌O157:H7的吸附能力更強(qiáng),對(duì)病原菌的乙酸代謝途徑相關(guān)基因的影響更顯著(pta上調(diào)6.1倍 9.3倍,ackA下調(diào)63.5% 91.7%)。pta上調(diào)和ackA下調(diào)會(huì)促進(jìn)胞內(nèi)乙酰磷酸的累積,加速細(xì)菌從游離態(tài)向生物被膜形態(tài)的轉(zhuǎn)變。此外,粘粒更有助于大腸桿菌O157:H7保持生理活性。8d后,粘粒中病原菌的腺苷-5′-三磷酸(ATP)的含量(0.36×10-18 mol ATP/CFU 0.39×10-18 mol ATP/CFU)顯著高于砂粒和粉粒中的病原菌ATP含量(0.13×10-18 mol ATP/CFU 0.21×10-18 mol ATP/CFU)。砂粒和粉粒去除有機(jī)質(zhì)后,大腸桿菌O157:H7的生理活性未發(fā)生明顯改變,且病原菌的存活時(shí)間顯著提高,表明有機(jī)質(zhì)的作用不是提供養(yǎng)分。而有機(jī)質(zhì)的去除,會(huì)提高土壤顆粒對(duì)病原菌的吸附能力。因此,我們推測(cè)難溶性有機(jī)質(zhì)的主要作用是遮蔽土壤顆粒的粘附位點(diǎn),影響細(xì)菌-土壤顆粒的界面作用,阻礙細(xì)菌粘附表型的轉(zhuǎn)變,最終影響病原菌的存活。上述結(jié)果表明,大腸桿菌O157:H7在土壤顆粒表面的粘附及其相關(guān)代謝途徑是存活優(yōu)勢(shì),幫助細(xì)菌在自然環(huán)境中的長(zhǎng)期存活。(3)明確了典型土壤粘土礦物(蒙脫石、高嶺石和針鐵礦)對(duì)大腸桿菌O157:H7生長(zhǎng),生物被膜形成和毒性基因表達(dá)的影響機(jī)制。帶負(fù)電的蒙脫石促進(jìn)大腸桿菌O157:H7的生長(zhǎng),抑制生物被膜的形成;邊面帶正電的高嶺石有利于病原菌的粘附,促進(jìn)生物被膜的形成;帶正電的針鐵礦顯著抑制病原菌的生長(zhǎng),促進(jìn)生物被膜的形成。熒光顯微鏡照片顯示,針鐵礦能有效粘附并殺滅大腸桿菌O157:H7,而高嶺石和蒙脫石均不影響病原菌的活性。原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡顯示了大腸桿菌O157:H7和礦物多樣的結(jié)合方式,蒙脫石疏散的分布在病原菌周圍,未發(fā)生有效粘附,高嶺石主要通過(guò)邊面和病原菌發(fā)生粘附,而針鐵礦緊密粘附在病原菌表面,形成礦物包被體。和空白對(duì)照相比(17.05±2.41nN),蒙脫石中形成的細(xì)菌生物被膜的粘性顯著降低(10.38±1.29nN)(P0.05),高嶺石略為促進(jìn)生物被膜的粘性(19.85±3.34nN),但不顯著(P0.05)。而針鐵礦誘導(dǎo)形成高粘性的生物被膜(29.00±4.84nN),并且生物被膜中的細(xì)菌形貌發(fā)生顯著變化:細(xì)胞變小、粗糙度增加且不規(guī)則。基因結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)大腸桿菌O157:H7生物被膜的形成機(jī)制。蒙脫石促進(jìn)病原菌中編碼鞭毛蛋白的基因-fliC的表達(dá),增加細(xì)菌的游動(dòng)性;下調(diào)編碼菌毛蛋白的基因-csgA,阻礙細(xì)菌的不可逆粘附(生物被膜形成的初始階段);下調(diào)莢膜異多糖(EPS重要組分)組分基因-wcaM,降低生物被膜的粘性,抑制生物被膜的形成和成熟。高嶺石體系中,病原菌的fliC下調(diào),而csgA上調(diào),利于細(xì)菌在界面上的不可逆粘附;wcaM上調(diào),會(huì)提高生物被膜的粘性,有利于生物被膜的形成。此外,pta上調(diào)和ackA下調(diào),導(dǎo)致乙酰磷酸的積聚,進(jìn)一步促進(jìn)菌毛和莢膜異多糖的分泌,加速生物被膜的成熟。針鐵礦不僅促進(jìn)莢膜異多糖的調(diào)控基因(rcsA,rcsB和rcsC)和wcaM的表達(dá),而且誘導(dǎo)病原菌群體密度感應(yīng)信號(hào)分子(Autoinducer-2)的調(diào)控基因-luxS的表達(dá),促進(jìn)生物被膜的形成。生物被膜形成初期,礦物的存在,會(huì)抑制生物被膜的形成,生物被膜量顯著低于純菌體系,但毒性基因的表達(dá)(stxA-1和stxA-2)出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)。生物被膜形成后期,針鐵礦和高嶺石體系中病原菌的生物被膜量顯著高于空白,而stxA-1和stxA-2的表達(dá)低于空白。因此,我們推測(cè)生物被膜形成和毒性表達(dá)可能是兩個(gè)互相排斥的過(guò)程。粘土礦物的理化性質(zhì)(電化學(xué)特性和形貌)是關(guān)鍵,決定礦物-病原菌的界面作用(結(jié)合方式和粘附強(qiáng)度),最終影響病原菌在土壤環(huán)境中的歸趨。
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【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S852.61;S154

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