發(fā)布時間：2017-12-21 04:34

  本文關鍵詞：亞硝酸鹽誘導水稻胚性愈傷組織的作用及其分子機理　出處：《武漢大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：水稻是重要的糧食作物,也是重要的單子葉模式植物。農桿菌介導的遺傳轉化技術是研究水稻功能基因組學最常用的手段之一,而建立穩(wěn)定、高效的組織培養(yǎng)轉化系統(tǒng)是其前提和基礎。影響水稻組織培養(yǎng)的因素很多,例如外植體的取材季節(jié)、取材部位、生理狀態(tài)、基因型、培養(yǎng)基中鹽類的組成及濃度、有機添加物的種類、生長調節(jié)劑的不同組合及配比等。氮源是組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中必不可少的成分,但亞硝酸鹽能否作為培養(yǎng)基的氮源成分未見報道,本研究系統(tǒng)分析了不同氮源對水稻愈傷組織生長和發(fā)育的影響,獲得的主要研究結果如下:以不同組合的硝酸鹽、亞硝酸鹽、銨鹽、谷氨酰胺作為培養(yǎng)基氮源,以愈傷組織的誘導重量、繼代增重倍數和分化率作為生長評價指標,檢測不同氮源對水稻愈傷組織的表型影響。結果顯示銨鹽和谷氨酰胺單獨或一起作為氮源均不能誘導愈傷組織形成、愈傷組織繼代的增重倍數較低、愈傷組織不能分化成苗,其中銨鹽在分化過程中甚至不能使愈傷組織轉綠,而低濃度的亞硝酸鹽(2 mM、5 mM)作為氮源效果優(yōu)良,在排除了鉀鹽和可能存在的硝酸鹽污染后,明確了NO_2~-發(fā)揮作用的可靠性。檢測不同的培養(yǎng)階段、不同的氮源培養(yǎng)基對愈傷組織中可溶性蛋白、硝酸鹽含量、亞硝酸鹽含量的影響。結果顯示不同氮源培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中可溶性蛋白含量不受氮源影響;在繼代和分化階段,以亞硝酸鹽或硝酸鹽作為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中亞硝酸鹽的含量在前三天有明顯升高、第三天達到峰值、之后呈下降的趨勢,而僅以銨鹽或谷氨酰胺作為氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中亞硝酸鹽含量無顯著變化;在一定的濃度范圍內,愈傷組織中亞硝酸鹽的含量與其生長指標正相關,而硝酸鹽的含量與生長指標不相關。鎢酸鈉特異性抑制硝酸還原酶(nitrate reductase,NR)的活性,利用此原理設計實驗,結果表明隨著培養(yǎng)基中鎢酸鈉濃度的升高,對以硝酸鹽作為氮源的愈傷組織生長發(fā)育的抑制作用越大,其原因是細胞內亞硝酸鹽含量的逐漸降低;而鎢酸鈉濃度的升高對以亞硝酸鹽作為培養(yǎng)基氮源的愈傷組織的生長發(fā)育無顯著性抑制,其原因是細胞內亞硝酸鹽含量無顯著變化。以受硝酸鹽誘導表達的四個基因為代表,檢測它們在不同氮源培養(yǎng)基上進行繼代和分化培養(yǎng)的愈傷組織中的表達情況。結果顯示它們在以硝酸鹽或亞硝酸鹽作為氮源的愈傷組織中高表達,而在僅以銨鹽作為氮源的愈傷組織體內低表達,表明亞硝酸鹽可能是真正誘導這些基因表達的物質,而非硝酸鹽。根據以上所有實驗結果推測,亞硝酸鹽極有可能對水稻愈傷組織的形態(tài)建成起信號分子的作用,而非硝酸鹽。檢測培養(yǎng)基的硝銨比對水稻愈傷組織的表型及其體內亞硝酸鹽含量的影響,仍以愈傷組織的誘導重量、繼代增重倍數和分化率作為生長評價指標,結果顯示在總氮量相同的情況下,粳稻中花11(簡稱ZH11)的愈傷組織在硝銨比為4:1時生長最好,同時愈傷組織中亞硝酸鹽的含量最高;秈稻9311的愈傷組織在硝銨比為2:1時生長最好,同時愈傷組織中亞硝酸鹽的含量最高。根據經驗,N6培養(yǎng)基是粳稻組織培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基及其改良培養(yǎng)基是秈稻組織培養(yǎng)最常用的培養(yǎng)基,而培養(yǎng)基之間最大的不同即在于無機總氮量和硝銨比的不同,N6和MS培養(yǎng)基的硝銨比分別是4:1和2:1。上述實驗結果可為此經驗做法提供一個解釋,即不同的硝銨比極可能影響了愈傷組織中亞硝酸鹽的含量,而亞硝酸鹽作為某種與生長發(fā)育有關的信號分子最終影響了愈傷組織的表型性狀。確定愈傷組織中一氧化氮(NO)與亞硝酸鹽的上下游信號分子的關系。實驗結果顯示,愈傷組織中NO的含量與亞硝酸鹽含量正相關,體外添加濃度逐漸增大的亞硝酸鹽導致酶上清液中檢測到NO特異性熒光成比例的增加,說明亞硝酸鹽很可能是愈傷組織中NO的主要來源。若除去愈傷組織中的NO,則成熟胚無法誘導出愈傷組織、愈傷組織不能分化,說明NO極可能也是水稻組織培養(yǎng)中一種與生長發(fā)育有關的信號分子。在9311愈傷組織繼代培養(yǎng)過程,NO供體亞硝基鐵氰化鈉(SNP)可以調節(jié)愈傷組織中NO的含量,以SNP、SNP+谷氨酰胺、SNP+銨鹽作為培養(yǎng)基氮源對愈傷組織的繼代增重倍數無顯著性影響,但SNP+亞硝酸鹽作為培養(yǎng)基氮源對愈傷組織的繼代增重倍數有顯著性提高,表明NO在亞硝酸鹽的下游發(fā)揮作用,愈傷組織中合適濃度的亞硝酸鹽是NO發(fā)揮作用的前提。為了解培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的添加對愈傷組織轉錄組的影響進行了 RNA-seq轉錄組測序。在繼代過程,亞硝酸鹽對有關苯基丙烷類物質合成的次級代謝通路影響大,造成多數基因下調表達,這與體外檢測亞硝酸鹽降低愈傷組織木質素含量的結果相符,木質素的降低有利于愈傷組織向胚性化方向發(fā)展。在分化過程,僅以亞硝酸鹽為氮源的愈傷組織中與逆境、脅迫、病害相關的基因大多會上調表達,α-淀粉酶前體基因上調表達,同時它對激素合成、代謝及細胞壁合成相關基因表達有很明顯影響。綜上所述,本研究進行了亞硝酸鹽在水稻組織培養(yǎng)中的開拓性工作,重新認識了亞硝酸鹽在植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中的作用,證實亞硝酸鹽不僅可以作為水稻組織培養(yǎng)的氮源營養(yǎng)成分,同時極有可能作為信號分子參與愈傷組織表型性狀的調控,這對水稻組織培養(yǎng)具有重要的理論意義和應用價值,其相關的分子轉導途徑有待進一步地研究。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S511

【參考文獻】

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本文編號：1314727