本文關(guān)鍵詞：鯉魚（Cyprinus carpio L.）IgT介導(dǎo)的粘膜適應(yīng)性免疫應(yīng)答的研究　出處：《山東師范大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：魚類是最早具有免疫球蛋白的脊椎動物,適應(yīng)性免疫對魚類防御病原菌感染具有重要的作用。同時,由于其特殊的水生生活環(huán)境,魚類的粘液性免疫非常發(fā)達(dá),在粘膜相關(guān)淋巴組織及其粘液中分布著大量的免疫球蛋白。這些存在于系統(tǒng)免疫器官和粘膜免疫組織中的抗體共同發(fā)揮著特異性免疫的保護(hù)作用。相比于哺乳動物,魚類粘膜特異性抗體的發(fā)現(xiàn)較晚,對其免疫作用機(jī)制及其與IgM之間的關(guān)系并不清楚,作為兩類獨立的淋巴細(xì)胞亞群,其抗體分泌細(xì)胞的作用和功能仍然需要更多的研究和探討,對魚類免疫球蛋白的研究有助于我們進(jìn)一步認(rèn)識免疫系統(tǒng)的進(jìn)化和發(fā)生。鯉魚是我國重要的經(jīng)濟(jì)魚類,嗜水氣單胞菌是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌之一,通過免疫的方法預(yù)防和控制養(yǎng)殖過程中的病害發(fā)生具有十分重要的意義,對鯉魚抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的研究有助于選擇正確的免疫預(yù)防策略。IgT(IgZ)是近年來新發(fā)現(xiàn)的魚類免疫球蛋白類型,在魚類粘膜組織中發(fā)揮著重要的特異性免疫防御作用。本實驗進(jìn)行了浸泡免疫后鯉魚頭腎和后腸轉(zhuǎn)錄組測序,并在此基礎(chǔ)上,以實驗室前期克隆得到的鯉魚IgT分子為研究對象,探討其在嗜水氣單胞菌刺激鯉魚過程中的免疫應(yīng)答變化,并對鯉魚IgT+B細(xì)胞進(jìn)行了定位觀察。實驗首先對嗜水氣單胞菌浸泡免疫刺激后頭腎和后腸組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序和分析。通過測序,共得到Unigene 139,751個,采用NR、GO、eggNOG、Swiss-Prot四個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋,分別獲得功能注釋基因61,585,33,091,58,807,49,696個,注釋序列占Unigene的比例為23.68%～44.07%。通過對浸泡免疫刺激后第3天和第7天頭腎和后腸轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的比較,分析了嗜水氣單胞菌浸泡后鯉魚兩種組織轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)基因。差異表達(dá)ungene的GO分析和KEGG分析結(jié)果表明,兩種組織中被活化的生物學(xué)通路是不同的,補(bǔ)體和凝集素信號途徑是頭腎中顯著活化的通路,此外還包括Toll樣受體、NF-κB以及TNF相關(guān)的信號通路。而在后腸中則是參與抗原處理和遞呈的通路被顯著活化,并且不同時段取材的后腸組織中,該通路的活化程度不同。此外,細(xì)胞粘附信號通路出現(xiàn)于腸組織Unigene最顯著富集的KEGG pathway中。在此基礎(chǔ)上,本實驗又進(jìn)一步篩選了頭腎和后腸轉(zhuǎn)錄組中與免疫球蛋白相關(guān)的unigene,結(jié)果發(fā)現(xiàn),頭腎中具有IgM和IgZ的同源序列,后腸中具有IgZ的同源序列,并且后腸轉(zhuǎn)錄組中Ig重鏈可變區(qū)的unigene更豐富,可變區(qū)unigene的增多和表達(dá)升高與腸道直接接觸病原菌進(jìn)而識別抗原表位的功能是相適應(yīng)的。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為進(jìn)一步研究鯉魚IgT在粘膜適應(yīng)性免疫中的作用提供了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組測序分析表明,浸泡刺激方式下IgZ在鯉魚頭腎和后腸組織均表達(dá),但是其抗原結(jié)合活性和活化的信號通路是不同的,因此,為了進(jìn)一步確定鯉魚IgT在這一過程中的免疫功能,本實驗采用注射和浸泡嗜水氣單胞菌兩種免疫刺激方式,比較分析在不同刺激方式下鯉魚各免疫相關(guān)組織中IgT和IgM在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),IgM和IgT在頭腎、脾臟、腸道及肝臟中表現(xiàn)出不同程度的免疫應(yīng)答反應(yīng),但是其表達(dá)變化的特征不同。與IgM相比,IgT在腸道組織中的表達(dá)倍增更顯著,尤其在浸泡組后腸。因此,鯉魚IgT在抗體介導(dǎo)的腸道粘膜組織特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。其次,對比兩種分子IgT和IgM的表達(dá)變化,可以發(fā)現(xiàn),IgM基礎(chǔ)表達(dá)量較高,雖然在刺激后表達(dá)倍增值普遍低于IgT,但是其絕對表達(dá)量并不低。本實驗又制備了 IgT-CH3區(qū)蛋白的單克隆抗體,運用IgT單克隆抗體以及IgM單克隆抗體對免疫應(yīng)答不同階段的鯉魚頭腎、脾臟和后腸組織IgT和IgM的表達(dá)進(jìn)行了 western-blotting檢測。實驗結(jié)果表明,鯉魚IgT和IgM的免疫活化過程是不同的,IgM可能更多的以組成型表達(dá)的方式發(fā)揮作用,而IgT具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答變化。同時,后腸是IgT產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,發(fā)揮免疫功能的重要位點。為了進(jìn)一步認(rèn)識IgT+B細(xì)胞在組織中的分布,本實驗通過IgT單克隆抗體對頭腎、脾臟以及后腸組織中IgT+B細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記。實驗結(jié)果可見,IgT+B細(xì)胞在頭腎和脾臟中均有分布,并且在免疫刺激后的組織中,其陽性信號增強(qiáng)。對IgT+B細(xì)胞進(jìn)一步的酶標(biāo)免疫組化顯示,該陽性細(xì)胞既出現(xiàn)于頭腎和脾臟的黑色素巨噬細(xì)胞中心,也出現(xiàn)于該中心以外的其他區(qū)域。而后腸組織中,IgT+B細(xì)胞在粘膜上皮細(xì)胞層和粘膜固有層都有分布,但是在粘膜固有層中的出現(xiàn)較晚,這可能與IgT+B細(xì)胞在后腸組織中的募集過程有關(guān)。綜上所述,鯉魚免疫球蛋白在系統(tǒng)免疫和粘膜免疫中都具有重要的作用,IgT作為腸道中具有較強(qiáng)免疫反應(yīng)的抗體分子,能夠產(chǎn)生針對嗜水氣單胞菌的特異性免疫應(yīng)答,表現(xiàn)出與IgM不同的應(yīng)答特征。對IgT免疫功能的研究有助于我們更深入的認(rèn)識魚類抗體介導(dǎo)的特異性免疫機(jī)制,并為進(jìn)一步研究魚類B淋巴細(xì)胞的分化和功能提供基礎(chǔ)資料。
【學(xué)位授予單位】：山東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S943

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