本文關鍵詞：白藜蘆醇對人膠質瘤及髓母細胞瘤細胞蛋白質組調節(jié)作用的初探

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【摘要】：背景及目的:人腦膠質瘤及髓母細胞瘤是臨床上常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,均具有較高的侵襲性及擴散性,目前臨床上尚無有效治療手段,即使采用手術結合放化療也會給患者預后造成很大影響。有研究表明,藥物治療是提高患者生存質量的重要手段。白藜蘆醇是具有多種生物學功效的天然多酚類化合物,其抗腫瘤作用日趨受到重視,本課題旨在研究白藜蘆醇對腦腫瘤細胞系蛋白質組的影響,探討白藜蘆醇可能的作用機制及細胞系敏感性差異原因,尋找可能存在的抗腫瘤作用靶點或腫瘤耐藥機制,為深入開展本領域研究、實現(xiàn)藥物臨床轉化及腫瘤個體化治療提供依據(jù)。實驗內容主要包括(1)蛋白質水平的影響:觀察對白藜蘆醇存在敏感性差異的不同腦腫瘤細胞系,在白藜蘆醇藥物處理前后,蛋白質組的改變。(2)篩選及鑒定:選取若干藥物處理前后存在差異表達的蛋白,運用質譜技術對其蛋白屬性加以鑒定。(3)差異蛋白質驗證:采用免疫組化和RT-PCR等方法,對鑒定出的蛋白在白藜蘆醇處理前后細胞中的表達進行核實。(4)數(shù)據(jù)整理分析:繪制可能存在的調控腫瘤生長的生物網(wǎng)絡。方法:(1)篩選與藥物處理:選取兩種腦腫瘤細胞系(膠質瘤及髓母細胞瘤),每種細胞系再分別選取對白藜蘆醇敏感性存在差異的細胞系(膠質瘤敏感型:U251、欠敏感型:LN18及髓母細胞瘤敏感型:UW228-3、欠敏感型:DAOY)。細胞系u251、ln18及uw228-3培養(yǎng)于低糖dmem培養(yǎng)基(low-dulbecco’smodifiedeaglemedium,l-dmem)中,daoy培養(yǎng)于rpmi1640培養(yǎng)基(roswellparkmemorialinstitute1640,rpmi1640)中,各培養(yǎng)基中分別含有10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素和鏈霉素),藥物處理組用100μm的白藜蘆醇(resveratrol,簡寫res)處理48h,收取細胞片用he染色觀察細胞形態(tài)。(2)蛋白雙向電泳分離及質譜鑒定:收取細胞提取全蛋白進行雙向凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-de),蛋白質酶切技術對變化差異點進行蛋白質酶切,質譜技術(massspectrometry,ms)對酶切樣品進行質譜鑒定。(3)蛋白鑒定結果驗證:采用免疫細胞化學及免疫印跡技術對發(fā)現(xiàn)的新的蛋白結果進行驗證,采用rt-pcr技術對調節(jié)新蛋白表達的基因進行基因水平的驗證。結果:(1)形態(tài)學改變:細胞系u251及uw228-3白藜蘆醇處理前后形態(tài)及數(shù)量上都有明顯的變化,均出現(xiàn)了神經(jīng)元樣變化且細胞數(shù)量減少,而細胞系ln18及daoy經(jīng)過白藜蘆醇處理前后,其形態(tài)和數(shù)量上幾乎沒有改變,提示:u251、uw228-3細胞系和ln18、daoy細胞系對白藜蘆醇存在明顯敏感性差異。(2)蛋白質組學實驗:1)蛋白質組整體影響:主要以上調為主,膠質瘤細胞系中,u251實驗組,正常組n檢出310個蛋白點,對照組res共檢出271個蛋白點,其中電腦軟件匹配結果共170個,上調比64.7%;在ln18細胞系中,正常組n檢出422個蛋白點,對照組res共檢出405個蛋白點,電腦軟件匹配共269個,上調比64.3%。髓母細胞瘤細胞系中,daoy組中,正常組n共檢出298個點,對照組res共檢出342個點,軟件匹配234個,上調比42.7%;uw228-3組中,正常組n共檢出177個點,對照組res共檢出118個點,軟件配對69個,上調比49.3%。2)差異蛋白質鑒定:蛋白質譜鑒定結果為烯醇化酶,磷酸甘油酸變位酶,角蛋白,膜聯(lián)蛋白,膜突蛋白,熱休克蛋白等。(3)差異蛋白質的驗證:隨機選取幾個蛋白進行rt-pcr驗證,eno1、pdia1、akr1b1等均表現(xiàn)為用藥后表達水平下降,而兩種角蛋白在兩種敏感性細胞系中幾乎未檢測到表達,在不敏感細胞系用藥后略有升高,cap1在daoy和u251中出現(xiàn)了上調,cap1在uw228-3中下調明顯,在ln18中變化不明顯。(4)選取的表達共性的蛋白烯醇化酶eno1的wb實驗結果與免疫細胞化學(icc)實驗結果一致,均出現(xiàn)了藥物處理后下調,與雙向電泳結果符合。結論:(1)初步得到了四種腦腫瘤細胞系白藜蘆醇處理前后蛋白質表達譜,為更深入的研究提供參考。(2)無論是敏感或不敏感的四種細胞系,在白藜蘆醇藥物處理后,各自的蛋白質組均有不同程度的改變。(3)藥物處理后,表達差異明顯的蛋白主要集中在能量代謝、細胞骨架結構、腫瘤遷移和炎癥應激反應等方面,提示白藜蘆醇可能具有多種生物學功能。(4)表達發(fā)生變化的這些蛋白質存在直接或間接地聯(lián)系,構成一種生物網(wǎng)絡,為下一步實驗研究指明了方向。
【關鍵詞】：白藜蘆醇 膠質瘤 髓母細胞瘤 差異蛋白質組學 雙向電泳 質譜
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R285
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-29
• 實驗結果29-47
• 討論47-51
• 實驗結論及進一步研究設想51-52
• 參考文獻52-56
• 綜述56-69
• 參考文獻64-69
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況69-70
• 致謝70-71

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本文編號：723353