本文關鍵詞：吡咯喹啉醌對促進軟骨細胞增殖及抑制IL-1β介導的軟骨細胞凋亡的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的觀察吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)對促進兔膝關節(jié)軟骨細胞的增殖及對IL-1β介導的軟骨細胞凋亡的影響,以探討PQQ在保護軟骨細胞方面的作用機制。方法1.在無菌的環(huán)境下取1月齡的新西蘭白兔的膝關節(jié)軟骨組織,加入0.2%的Ⅱ型膠原酶對其進行消化,消化完成后用200目鋼網過濾、離心、重懸軟骨細胞于含10%FBS及1%雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)液中,然后放于37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)軟骨細胞。2.倒置相差顯微鏡下觀察原代軟骨細胞自接種到培養(yǎng)皿中開始直到基本長滿培養(yǎng)皿底部時的不同時期的形態(tài)。3.取第2代對數生長期的軟骨細胞,調整至合適的細胞密度,細胞貼壁后用PQQ濃度分別為0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0μmol/L的無血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)軟骨細胞48h,采用MTT法來檢測軟骨細胞的增殖活力。4.將第2代對數生長期的軟骨細胞調至適當密度后接種于6個100mm培養(yǎng)皿中,24h貼壁后,棄上清,分別加用PQQ濃度為0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0μmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30h,收集軟骨細胞,取1ml的單細胞懸液離心去掉上清,加入70%冷乙醇500μl固定,4℃過夜,PBS洗去固定液,加入100μl RNase A37℃水浴30min,再加入400μl的Propidium Iodide染色混勻后用流式細胞儀檢測細胞周期,計算軟骨細胞增殖指數。5.在100mm培養(yǎng)皿中接種軟骨細胞,細胞貼壁后用PQQ濃度分別為0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0μmol/L無血清培養(yǎng)基預處理軟骨細胞24h,然后加入終濃度為10 ng/mL的IL-1β,繼續(xù)作用15h,收集上清液,與用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化收集后的細胞懸液混合,離心,預冷PBS洗滌細胞,加入200μl的Binding Buffer懸浮細胞,然后加入5μl的Annexin V-FITC(AV)混勻,繼續(xù)加入5μl Propidium Iodide(PI)混勻,避光、室溫孵育15min,加入300μl Binding Buffer輕輕混勻。采用流式細胞術測軟骨細胞的凋亡率。結果1.實驗中的軟骨細胞貼壁后細胞呈現三角形、多角形或不規(guī)則形,當軟骨細胞生長連接成片時可見呈現“鋪路石樣”。2.MTT實驗結果顯示,與對照組相比軟骨細胞的增殖活力隨PQQ濃度的增加而成逐漸升高的趨勢,差異具有統計學意義(P0.05),在PQQ濃度為25.0μmol/L時達到最大值,50.0μmol/L和100.0μmol/L時細胞增殖活力下降。3.PQQ能明顯提高軟骨細胞的增殖活力、S(%)期,G2/M(%)的比例和軟骨細胞的增殖指數(P0.05),且在PQQ濃度為12.5μmol/L和25.0μmol/L時作用最強。4.PQQ能明顯抑制IL-1β介導的軟骨細胞早期凋亡和晚期凋亡(P0.05),在PQQ濃度為25.0μmol/L時作用最明顯。結論PQQ可以促進膝關節(jié)軟骨細胞的分裂與增殖,對IL-1β介導的軟骨細胞的凋亡具有抑制作用。
【關鍵詞】：吡咯喹啉醌 軟骨細胞 流式細胞術 細胞周期 細胞凋亡
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R68
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-17
• 1.實驗材料13-14
• 1.1 實驗對象13
• 1.2 藥品與試劑13
• 1.3 主要儀器13-14
• 1.4 溶液配制14
• 2.實驗方法14-16
• 2.1 軟骨細胞提取和培養(yǎng)14-15
• 2.2 軟骨細胞的形態(tài)學觀察15
• 2.3 MTT比色法測細胞增殖15
• 2.4 細胞周期的檢測15-16
• 2.5 細胞凋亡的檢測16
• 3.統計學分析16-17
• 結果17-21
• 1.軟骨細胞的形態(tài)學觀察17-18
• 2. 不同濃度PQQ對軟骨細胞增殖活力的影響18
• 3. 不同濃度PQQ對軟骨細胞周期的影響18-19
• 4．不同濃度PQQ對抑制IL-1β 介導的軟骨細胞凋亡的影響19-21
• 討論21-22
• 結論22-23
• 參考文獻23-26
• 綜述26-37
• 參考文獻32-37
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況37-38
• 致謝38-39

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7 張e，

本文編號：281213