發(fā)布時間：2020-01-21 18:01

【摘要】：目的:缺血性腦中風(fēng)是一類嚴(yán)重危害人類身體健康的心腦血管疾病。大量研究證明線粒體在缺血再灌注階段的神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)揮重要作用,并已成為一個有效干預(yù)腦中風(fēng)神經(jīng)損傷的新靶點。沒食子酸(Gallic acid,GA)是一種來源于掌葉大黃、大葉桉、山茱萸等植物的一種多酚類化合物,具有顯著的抗氧化功效。為進(jìn)一步研究GA是否具有對抗缺血性腦中風(fēng)作用,并論證其作用是否與靶向線粒體有關(guān),進(jìn)行了本研究,本研究將為GA應(yīng)用于缺血性腦中風(fēng)提供了新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。方法:為研究GA對缺血性腦中風(fēng)的藥效學(xué)效應(yīng),在第一部分在體試驗中采用大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)的方法建立實驗性缺血性腦中風(fēng)模型,分設(shè)假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、MCAO+GA 25 mg/kg組、MCAO+GA 50mg/kg組、MCAO+CSA 10 mg/kg組,比色法檢測缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞SOD活力,HE染色檢測腦組織細(xì)胞變化,TTC法檢測腦梗死體積,TUNEL染色法檢測神經(jīng)元凋亡情況,Western blot法檢測檢測Cyt C的釋放水平。離體試驗部分,采用Na_2S_2O_4法構(gòu)建缺氧復(fù)氧損傷細(xì)胞模型,分別預(yù)作用以不同濃度的GA(0.1、1、10μmol/L)后,MTT法檢測細(xì)胞活性,DCFH-DA熒光探針法檢測ROS含量,Mitosox red熒光探針法檢測線粒體ROS,Clark氧電極測細(xì)胞耗氧量,熒光素酶法測細(xì)胞內(nèi)ATP含量。通過以上試驗系統(tǒng)評價GA的抗缺血性腦中風(fēng)作用,并對其是否具有保護(hù)線粒體功能的性質(zhì)進(jìn)行初步探討。為進(jìn)一步明確GA保護(hù)線粒體功能的相關(guān)位點,在第二部分離體實驗試驗中采用H_2O_2法構(gòu)建了細(xì)胞mPTP開放模型,MTT法檢測細(xì)胞活性,Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡水平,JC-1染色、Calcein AM-CoCl_2和Cyt C免疫染色評估m(xù)PTP的開放程度,比色法檢測細(xì)胞SOD活力及MDA含量,Western blot法檢測Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9,以及Cyt C的釋放水平。在體試驗部分,提取小鼠離體肝臟線粒體,Calcium Green5N熒光標(biāo)記后,使用瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀檢測離體線粒體對鈣離子的攝取能力。通過以上試驗,系統(tǒng)評價了GA靶向mPTP保護(hù)線粒體功能的作用。為明確GA作用mPTP的相關(guān)作用機(jī)制,在第三部分在體試驗中提取小鼠離體肝臟線粒體,Ca~(2+)刺激離體線粒體后,免疫共沉淀法檢測CypD與ANT-1的結(jié)合程度,酶標(biāo)儀檢測GA對CypD的氨基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性的影響,建立MCAO模型,TTC法檢測腦梗死體積,離體實驗試驗中采用H_2O_2法構(gòu)建了細(xì)胞mPTP開放模型,Western blot檢測Cleaved caspase-3、CypD、p-ERK的表達(dá)水平,Calcein AM-CoCl_2染色評估m(xù)PTP的開放程度,最后采用ERK通路抑制劑U0126分別從在體和離體兩個層面反向驗證以上GA作用是否是通過調(diào)控ERK通路發(fā)揮保護(hù)作用。結(jié)果:在第一部分中,本研究組發(fā)現(xiàn)GA可有效對抗MCAO及Na_2S_2O_4所致的神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷。與模型組相比,GA50 mg/kg組大鼠大腦梗死體積,TUNEL陽性細(xì)胞數(shù),Cyt C釋放量均顯著性下降,此外,預(yù)防性給予GA后大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞SOD水平有顯著性升高,這些結(jié)果均提示GA具有良好的對抗腦缺血再灌注損傷的作用。重要的是GA的這些神經(jīng)保護(hù)作用可能與其保護(hù)線粒體功能密切相關(guān),與模型組相比,GA可顯著性抑制Na_2S_2O_4所致的線粒體膜電位下降、ATP含量以及耗氧量的減少、細(xì)胞總ROS水平以及線粒體ROS的增加,這些結(jié)果表明GA具有對抗缺血性腦中風(fēng)的作用,且與其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能密切相關(guān)。在第二部分中,本研究組發(fā)現(xiàn)GA保護(hù)線粒體對抗缺氧損傷與其作用mPTP,提高線粒體鈣閾值水平有關(guān)。與對照組相比,500μmol/L H_2O_2作用后,細(xì)胞內(nèi)Calcein AM水平下降,膜電位水平降低,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達(dá)水平升高,Cyt C釋放增加表明SH-SY5Y細(xì)胞mPTP開放。預(yù)作用GA后可顯著性逆轉(zhuǎn)H_2O_2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞mPTP開放,促進(jìn)細(xì)胞的存活,抑制其細(xì)胞凋亡的發(fā)生。離體小鼠肝臟線粒體鈣攝取能力試驗結(jié)果顯示,與對照組相比,GA作用后線粒體鈣攝取能力顯著性升高,以上結(jié)果證明mPTP是GA保護(hù)線粒體功能的靶點之一。在第三部分中,本研究組發(fā)現(xiàn),與對照組相比,GA作用后CypD氨基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性顯著性升高,而在離體小鼠肝臟線粒體中Cy PD-ANT-1復(fù)合物水平顯著下降。有趣的是,在EGF誘導(dǎo)以及MCAO損傷刺激條件下,伴隨著ERK磷酸化水平的升高,SH-SY5Y細(xì)胞中CypD表達(dá)水平顯著性下降,且采用U0126抑制ERK磷酸化后,GA對抗H_2O_2誘導(dǎo)的mPTP開放以及MCAO誘導(dǎo)的腦缺血損傷效應(yīng)均被逆轉(zhuǎn),與單用GA組相比,聯(lián)合GA和U0126組細(xì)胞內(nèi)Calcein AM水平顯著性下降,Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9的表達(dá)水平升高,腦梗死體積顯著性升高。這些結(jié)果表明GA一方面直接影響CypD氨基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性,抑制其于ANT-1結(jié)合,另一方面通過作用ERK磷酸化水平,反向抑制CypD的表達(dá),提高mPTP的開放閾值,發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)論:GA通過直接影響CypD與ANT-1結(jié)合及影響ERK磷酸化水平,抑制CypD表達(dá),提高線粒體mPTP開放閾值,有效對抗缺血性腦中風(fēng)病理過程中神經(jīng)細(xì)胞損傷。鑒于mPTP在多種氧化應(yīng)激損傷過程中的關(guān)鍵作用,GA可能成為該類疾病的潛在治療藥物,其成藥性值得進(jìn)一步研究。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

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本文編號：2571676