本文關鍵詞：乳酸桿菌表面活性片段通過表觀遺傳學調(diào)控腸上皮炎性細胞因子表達的機制研究

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【摘要】：目的觀察MIMP對炎癥性腸病小鼠的腸道炎癥及腸道微生態(tài)的影響;探究MIMP對炎性細胞因子的作用效果和調(diào)節(jié)方式,并探討相關作用機制。方法(1)將小鼠分為3組:DSS+MIMP組,DSS組和健康對照組。干預期間,觀察小鼠體重變化情況,腹瀉、血便、死亡等發(fā)生率,觀察各組小鼠腸道整體情況并制作HE染色切片,觀察腸上皮組織病理學的改變;利用右旋糖苷異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate-dextran,FITC-Dextran)灌胃,檢測小鼠活體腸道通透性,并利用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative PCR,q RT-PCR)檢測各組小鼠腸道上皮中緊密連接蛋白(JAM-1,Occludin,ZO-1)的表達水平;利用q RT-PCR檢測各組小鼠腸道上皮中炎性細胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10)的表達,利用16Sr RNA測序技術檢測各組小鼠腸道微生態(tài)的變化情況。(2)利用類小腸上皮細胞的Caco-2細胞和外周血單核細胞(PBMCs)在Tranwells條件下建立共培養(yǎng)模型,利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為炎癥刺激,利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對腸道微環(huán)境中炎性細胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23,IL-4,IL-10)的調(diào)節(jié)情況。利用ELISA和q RT-PCR檢測TLR4抑制劑對LPS介導的炎性細胞因子分泌水平的影響,并與MIMP的作用效果相互比較。利用Western blot檢測MIMP和TLR4抑制劑對MAPK及NF-κB通路的調(diào)節(jié)情況,并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對NF-κB活性影響的變化趨勢。(3)利用Western blot檢測MIMP及TLR4抑制劑對由LPS介導的Caco-2細胞整體水平的組蛋白(H3,H4)乙�；恼{(diào)節(jié)情況,利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(Ch IP)技術檢測MIMP在不同濃度及不同孵育時間下對具體水平的IL-17及IFN-γ上游啟動子區(qū)域組蛋白(H3,H4)乙�；恼{(diào)節(jié)情況;利用q RT-PCR檢測MIMP對LPS介導的組蛋白去乙�；�(histone deaceylase,HDAC)表達水平的調(diào)節(jié)情況。結(jié)果(1)與DSS組小鼠相比,MIMP+DSS組整體情況較好,體重減輕程度輕,腹瀉、便血及死亡發(fā)生率低,疾病活動指數(shù)顯著下降;MIMP不但可以改善腸道整體情況,提高腸道長度(p0.05),還可有效提升組織學評分(p0.001);MIMP+DSS組血漿中FITC-Dextran的含量顯著低于DSS組(p0.01),而腸上皮中緊密連接蛋白(JAM-1,Occludin,ZO-1)的表達水平則顯著高于DSS組(p0.01)。此外,MIMP可降低腸道上皮中促炎性細胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23)的水平,并升高抑炎性細胞因子(IL-4,IL-10)的水平。16Sr RNA測序發(fā)現(xiàn)MIMP+DSS組較DSS腸道微生態(tài)多樣性顯著提升,shannon指數(shù)顯著降低(p0.05),simpson指數(shù)存在一定上升趨勢(p=0.055);主坐標分析(principal coordinate analysis,PCo A)提示三組小鼠腸道微生態(tài)在各分類學水平上存在明顯差異;樣本聚類樹與柱狀圖組合分析(The sample clustering tree and histogram analysis)提示MIMP+DSS組與健康對照組腸道微生態(tài)的相似程度更高;線性判別分析(LEf Se)分析顯示厚壁菌屬(Firmicute)是DSS組小鼠腸道中的優(yōu)勢菌屬,明串珠菌屬(Leuconostocaceae)是DSS+MIMP組的優(yōu)勢菌屬,擬桿菌屬(Bacteroides)是健康對照組腸道中的優(yōu)勢菌屬。(2)在共培養(yǎng)模型中,MIMP可扭轉(zhuǎn)因LPS引起的炎性細胞因子的分泌,降低促炎性細胞因子(IFN-γ,IL-17,IL-23)的水平,升高抑炎性細胞因子(IL-4,IL-10)的水平;且MIMP的調(diào)節(jié)存在一定的劑量與時間依賴性,在特定濃度和時間時(1ng/ml,12h),MIMP的作用效應最為顯著;同時抑制性實驗證實MIMP與TLR4抑制劑具有相同的調(diào)節(jié)炎性細胞因子的能力;此外,MIMP和TLR4抑制劑均可有效阻斷MAPK及NF-κB通路激活,且隨著MIMP劑量的提高和時間的延長,NF-κB的活性也呈現(xiàn)階梯狀下降趨勢。(3)LPS可使得組蛋白(H3,H4)整體水平的乙酰化程度提高,而MIMP與TLR4抑制劑干預可有效降低其乙�；潭�,并存在劑量依賴性;在具體水平中,隨著劑量的提高和時間的延長,MIMP可有效降低IL-17和IFN-γ上游啟動子區(qū)域組蛋白(H3,H4)的乙�；潭�;同時,MIMP還可以顯著上調(diào)部分HDAC的表達。結(jié)論MIMP可有效改善IBD小鼠的炎癥狀態(tài)及腸屏障功能,顯著下調(diào)促炎性細胞因子的表達,上調(diào)抑炎性細胞因子的表達,并糾正IBD小鼠的腸道微生態(tài)紊亂;MIMP可通過一定劑量和時間依賴的方式調(diào)節(jié)炎性細胞因子的分泌,并可有效阻斷MAPK及NF-κB信號通路的激活;MIMP可有效降低整體及具體水平的組蛋白乙酰化程度,提高HDAC的表達。本研究發(fā)現(xiàn)了MIMP改善腸道炎癥的現(xiàn)象并闡明其相關機制,擴展了人們對于炎癥治療的認識,具有一定的理論創(chuàng)新。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R574

【參考文獻】

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2 Mary Pat Moyer;;Protective effects ofLactobacillus plantarum against epithelial barrier dysfunction of human colon cell line NCM460[J];World Journal of Gastroenterology;2010年45期

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本文編號：1288323