本文關鍵詞：賴氨酸氧化酶和血管內皮生長因子在缺氧微環(huán)境中促進乳腺癌發(fā)生上皮間質轉化的機制研究

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【摘要】：研究背景:乳腺癌在全球范圍內為女性最常見的惡性腫瘤,死亡率較高。在腫瘤的演進過程中,腫瘤轉移是導致乳腺癌患者死亡的最主要原因。缺氧微環(huán)境廣泛存在于實體腫瘤中,在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,研究表明,25%-40%的侵襲性乳腺癌都發(fā)生在組織相對缺氧的區(qū)域。在缺氧微環(huán)境中,缺氧誘導因子1(Hypoxia-inducible factor HIF-1)被激活,從而調控其下游因子的表達,包括賴氨酸氧化酶(lysyl oxidase LOX)和血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial cell groeth factor VEGF),引起一系列的缺氧適應性反應。研究已經證實腫瘤組織內缺氧是影響腫瘤患者生存率的獨立因素(獨立于臨床分期、病理分級、淋巴結轉移情況等)。缺氧部位的腫瘤細胞具有更強的侵襲性表型,增加了乳腺癌的轉移風險和對放、化療的耐受,并且誘導癌細胞發(fā)生免疫逃逸。大多數(shù)惡性腫瘤在演進過程中均伴有上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)過程的發(fā)生,EMT是上皮細胞經過特定程序獲得細胞間質表型特征的生物學過程。也是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得侵襲和遷移能力的重要生物學過程,從而使腫瘤細胞獲得更強的侵襲和轉移的能力,不僅如此,EMT在缺氧微環(huán)境中也發(fā)揮了重要的作用。在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉移及多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用,其主要特征包括細胞粘附分子(如E-鈣黏蛋白)表達減少、角蛋白細胞骨架轉化為波形蛋白(vimentin)為主的細胞骨架及形態(tài)上具有間質細胞的特征,波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白表達增多,多種蛋白酶表達升高,如基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。在EMT過程中,上皮細胞失去了細胞極性,失去與基底膜連接等的上皮表型,獲得了較高的遷移和侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質能力等的間質表型。EMT是一個由多種途徑共同調控的過程,參與EMT過程的細胞內信號轉導途徑包括TGF-β/Smad途徑、Wnt/β-catenin途徑、受體酪氨酸激酶Ras-MAPK途徑、Src激酶、Rho家族激酶、PI3K/AKT途徑等。缺氧可影響EMT的相關基因表達,進一步誘導干細胞表型。EMT過程中,細胞和細胞之間的連接成分減少,細胞骨架重塑獲得紡錘樣的細胞形態(tài),動態(tài)的肌動蛋白微絲網絡移動性增加,為腫瘤轉移提供可能。在腫瘤轉移的過程中,上皮細胞離開原發(fā)腫瘤部位,黏附并侵襲基質部位,進入血液循環(huán)并且擴散到達遠處的組織器官,在遠處的組織內增殖形成繼發(fā)腫瘤。EMT被認為是腫瘤發(fā)生轉移的這個復雜過程中的第一步。轉移是腫瘤致死的主要原因之一,因為腫瘤一旦發(fā)生轉移,病灶將擴散至全身,越來越多的研究顯示,缺氧微環(huán)境可以促使腫瘤細胞的轉移。50%-60%的實體腫瘤中存在低氧和(或)缺氧區(qū)域,低氧環(huán)境可以誘導細胞內基因表達重新編程,并最終導致細胞侵襲行為的發(fā)生。HIF-1通過上調EMT相關轉錄因子或抑制因子,激活EMT相關的信號轉導通路,調控EMT相關的炎癥細胞因子,同時也調控其他的信號轉導途徑。比如,HIF-1通過轉錄調控E-cadherin,SNAIL、ZEB1、TWIST、TCF3(transcription factor 3)幾種因子誘導EMT過程。本研究以人乳腺癌為研究對象,探討缺氧微環(huán)境與上皮間質轉化之間的相互作用,從而為藥物研發(fā)和臨床治療提供理論依據(jù)。方法:實驗分為兩組:空白對照組(0μmol/L),Co Cl2濃度梯度處理組(50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L,400μmol/L)。(1)劃痕實驗檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞遷移能力的變化:各處理組的細胞無血清培養(yǎng)48h,分別于0h,24h以及48h時取樣拍照,測量細胞遷移距離。采用Transwell實驗檢測各組細胞侵襲能力的變化:各處理組細胞分別培養(yǎng)24h以及48h后取樣拍照,并計數(shù)其穿膜細胞數(shù)量。(2)Western blot技術檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞內蛋白水平的變化。檢測指標包括:缺氧誘導因子HIF,金屬基質蛋白9—MMP-9,上皮標記物—E-cadherin,間質標記物—Vimentin,PI3K-AKT通路關鍵分子—PI3K,AKT。(3)ELISA技術檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞分泌物中分泌型蛋白的表達。檢測指標包括:血管內皮生長因子—VEGF,賴氨酸氧化酶—LOX.(4)免疫共沉淀實驗檢測MCF-7和MDA-MB-231細胞在缺氧環(huán)境中表達的VEGF和LOX的相互作用。結果:(1)劃痕及侵襲實驗結果顯示:缺氧微環(huán)境賦予乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞更強的遷移、侵襲能力。(2)通過western blot技術對EMT標記物的監(jiān)測發(fā)現(xiàn):缺氧環(huán)境中,與對照組相比,上皮標記物—E-cadherin低表達。間質標記物—Vimentin高表達,與侵襲轉移相關的金屬基質蛋白酶9—MMP-9高表達,同時對誘導EMT的受體酪氨酸激酶(RTKs/RPTK)的PI3K-AKT通路中重要靶點PI3K和AKT進行檢測,發(fā)現(xiàn)二者的表達同時上調,與對照組差異顯著。暗示缺氧誘導的上皮間質轉化是通過激活該通路實現(xiàn)的。(3)通過western blot和ELISA技術發(fā)現(xiàn),在缺氧環(huán)境中,血管內皮生長因子和賴氨酸氧化酶同時高表達,基于缺氧微環(huán)境和上皮間質轉化在促進腫瘤轉移當中的重要作用,二者分別作為缺氧誘導因子HIF下游的重要靶點和誘導EMT的受體酪氨酸激酶(RTKs/RPTK)家族中的關鍵分子,二者的表達量增加可能具有相關性。(4)免疫共沉淀技術進一步驗證血管內皮生長因子和賴氨酸氧化酶在誘導乳腺癌細胞發(fā)生上皮間質轉化過程的缺氧微環(huán)境中發(fā)揮了協(xié)同作用。使用二者的抑制劑有望在臨床上為抑制腫瘤的轉移提供新思路。結論:缺氧微環(huán)境可以誘導乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231發(fā)生上皮間質轉化,使其具有更強的侵襲、遷移能力。該效應是通過激活PI3K-AKT通路實現(xiàn)的。在缺氧環(huán)境下,血管內皮生長因子和賴氨酸氧化酶同時高表達,且二者之間具有相互作用,二者在缺氧微環(huán)境中可能協(xié)同作用促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移。
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

【參考文獻】

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1 Zhao-ji LIU;Gregg L.SEMENZA;Hua-feng ZHANG;;低氧誘導因子與乳腺癌轉移(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年01期

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本文編號：1282779