本文關(guān)鍵詞：基于高內(nèi)涵技術(shù)的腎纖維化體外模型建立及中藥化合物篩選

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【摘要】：腎纖維化是各種慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)進(jìn)展至終末期腎病(end stage renal disease,ESRD)的共同病理過程,其主要特征是持續(xù)存在的慢性損傷導(dǎo)致腎臟的固有細(xì)胞和結(jié)構(gòu)不斷遭到破壞,取而代之的是不斷積聚的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM),進(jìn)而腎臟正常功能逐漸衰減。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于慢性腎病、終末期腎病的治療,尚缺乏行之有效的方法與藥物。而中醫(yī)藥在腎纖維化的治療中顯示出了較好的應(yīng)用前景。目的:本課題依托藥物高內(nèi)涵篩選技術(shù)平臺(tái),探索建立可用于抗腎纖維化藥物高內(nèi)涵篩選的體外細(xì)胞模型,選用文獻(xiàn)報(bào)道中具有抗腎纖維化功效的化合物進(jìn)行模型評價(jià)和驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上對344種中藥化合物進(jìn)行高內(nèi)涵篩選,以期發(fā)現(xiàn)具有抗腎纖維化功效的化合物,為下一步的藥物研發(fā)和相關(guān)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。方法:1.腎纖維化體外高內(nèi)涵藥物篩選模型的建立:采用正常大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK49F作為研究對象,以轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)作為誘導(dǎo)劑,分別設(shè)置不同細(xì)胞種板密度、不同誘導(dǎo)時(shí)間以及不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中血清濃度的實(shí)驗(yàn)組,以肌成纖維細(xì)胞的主要標(biāo)記物αα-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)為檢測指標(biāo),通過高內(nèi)涵分析系統(tǒng)對不同組別NRK49F細(xì)胞的α-SMA表達(dá)情況進(jìn)行檢測分析,以誘導(dǎo)組與空白對照組α-SMA表達(dá)差異最大的組別實(shí)驗(yàn)條件作為模型建立的條件。2.腎纖維化體外高內(nèi)涵藥物篩選模型的評價(jià)與驗(yàn)證:在確立的模型優(yōu)化條件下,以TGF-β1受體阻滯劑SB525334和文獻(xiàn)報(bào)道的具有抗腎纖維化功效的中藥化合物姜黃素、大黃素為陽性藥物,利用高內(nèi)涵分析系統(tǒng)檢測上述化合物對TGF-β1誘導(dǎo)的NRK49F細(xì)胞α-SMA表達(dá)的影響。3.抗腎纖維化中藥化合物的高內(nèi)涵篩選:在成功建立細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上,以α-SMA為評價(jià)指標(biāo),將344種中藥化合物進(jìn)行以10μmol/L的濃度進(jìn)行初步篩選,從中篩選獲取可能具有抗腎纖維化活性的化合物。將篩選獲取的化合物分別設(shè)置最高濃度為72 μmol/L,3等倍稀釋5個(gè)濃度梯度的不同實(shí)驗(yàn)組,進(jìn)一步檢測分析其對細(xì)胞模型中α-SMA和Ⅲ型膠原表達(dá)的影響。結(jié)果:1.通過對細(xì)胞種板密度、誘導(dǎo)時(shí)間以及誘導(dǎo)培養(yǎng)基中血清濃度等各種條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定了模型建立的條件:細(xì)胞接種于96孔板,種板密度為6,000個(gè)/孔,將TGF-β1加入到含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,誘導(dǎo)濃度為10 μ g/L,誘導(dǎo)時(shí)間為72h。2.TGF-β 1受體阻滯劑SB525334和文獻(xiàn)報(bào)道的具有抗腎纖維化功效的中藥化合物姜黃素、大黃素均能在一定程度上抑制α-SMA的表達(dá),與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致。3.通過對實(shí)驗(yàn)室344種中藥化合物進(jìn)行篩選,獲得了具有抗腎纖維化活性的化合物16種。其中,迷迭香酸對α-SMA以及Ⅲ型膠原的表達(dá)無明顯影響;貝母素乙、歐前胡素、人參皂苷F2、新橙皮苷有下調(diào)α-SMA的表達(dá)的趨勢,但對Ⅲ型膠原的表達(dá)無明顯影響;丹酚酸B、丹參素、�；撬崦黠@下調(diào)Ⅲ型膠原的表達(dá),但對α-SMA的表達(dá)無明顯影響;姜黃素、大黃素、甘草酸、川芎嗪、羥基紅花黃色素A、黃芪甲苷、絞股藍(lán)皂苷、西紅花苷則對α-SMA和Ⅲ型膠原的表達(dá)均有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.通過對腎纖維化細(xì)胞模型誘導(dǎo)的條件進(jìn)行優(yōu)化,構(gòu)建了適用于高內(nèi)涵篩選平臺(tái)的腎纖維化體外細(xì)胞模型,并驗(yàn)證了模型的穩(wěn)定性,為開展相關(guān)藥物的研發(fā)和機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。2.篩選出了十余種具有抗腎纖維化功效的中藥化合物,其中甘草酸、羥基紅花黃色素A、西紅花苷、絞股藍(lán)皂苷等此前未見有抗腎纖維化的研究報(bào)道。這幾種化合物可作為課題組后期開展體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的候選藥物。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284;R285

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本文編號(hào)：1264702