本文關(guān)鍵詞：海洋微藻DNA條形碼基因的評估及環(huán)境樣本多樣性分析和定量基因的開發(fā)

  更多相關(guān)文章： DNA條形碼 硅藻 甲藻 rDNA actin Miseq測序 群落結(jié)構(gòu)

【摘要】：海洋微藻不僅在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占有十分重要的生態(tài)地位,而且其結(jié)構(gòu)成分和分泌物等是巨大的可開發(fā)利用的海洋資源,而硅藻和甲藻是海洋微藻的主要類群,因此,對其進行準(zhǔn)確地分類鑒定是其他相關(guān)工作的研究基礎(chǔ)。DNA條形碼技術(shù)作為傳統(tǒng)分類學(xué)鑒定的補充手段發(fā)揮了非常重要的作用。但硅藻和甲藻的DNA條形碼研究起步較晚,尚未找到分別適合的統(tǒng)一的DNA條形碼基因,現(xiàn)有的研究也主要是分別針對特定的分類單元進行條形碼基因的檢測,并未在整個類群上對候選基因進行過評估。此外,目前對海洋微藻群落結(jié)構(gòu)的研究,一是顯微鏡檢,但該方法受限于形態(tài)學(xué)鑒定的局限性,二是利用rDNA的擴增子測序信息來反映群落中微藻的組成結(jié)構(gòu),但rDNA在不同真核生物中的的拷貝數(shù)差異很大。因此根據(jù)rDNA擴增子測序所得的序列豐度對環(huán)境樣本中真核微生物群落的相應(yīng)物種的豐度評估可能存在誤差。一些拷貝數(shù)較少的核編碼的蛋白基因已被用于甲藻的系統(tǒng)發(fā)育分析,將此類基因用于群落結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果應(yīng)該會更加準(zhǔn)確。因而,本文針對研究較為廣泛的硅藻,對選取的候選條形碼基因rDNA ITS rDNA、COI和rbcL,分別進行通用引物的設(shè)計和驗證,聯(lián)合NCBI上的序列計算硅藻門各基因的遺傳差異并構(gòu)建貝葉斯樹,評估其在硅藻門內(nèi)物種的聚類情況,以分析各段標(biāo)記適用于硅藻聚類關(guān)系中的分類單位；然后利用硅藻模擬混合樣本進行rDNA擴增子克隆測序,評估rDNA序列的豐度反應(yīng)環(huán)境樣本中真核微生物群落的相應(yīng)物種豐度的準(zhǔn)確性；并對具有一定的甲藻物種區(qū)分能力的拷貝數(shù)較低的核編碼蛋白基因(HSP90、elf2、actin)設(shè)計通用引物,分析其對甲藻物種的區(qū)分度后,利用甲藻模擬群落和選定的actin基因構(gòu)建克隆文庫初步評估該基因?qū)自逦锓N進行定量的準(zhǔn)確性;最后比較18S v9區(qū)和actin基因的Miseq測序測序結(jié)果,進行硅藻和甲藻模擬群落的物種豐度和多樣性分析,并建立基因序列與生物量之間的關(guān)系。得到的結(jié)果如下：利用設(shè)計的通用引物將18S rDNA、ITS rDNA、COI和rbcL基因在分離的37株硅藻中均獲得了擴增和測序,測得的序列Blast結(jié)果顯示,rbcL基因的正確率最高(88.9%),18S次之,而COI的錯誤率最高(25%)。遺傳差異和構(gòu)建的貝葉斯樹顯示,18S rDNA的遺傳變異度比較適中,可以在較高的分類水平上對硅藻進行聚類,也可以對直鏈藻屬、楔形藻屬、骨條藻屬和雙肋藻科等較低分類單位進行聚類分析。ITS和COI基因在硅藻門內(nèi)遺傳變異的程度很大,不再適用于較高分類單位的聚類分析,但是ITS適合用于海鏈藻目物種的DNA條形碼鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析,而COI則更適合于羽紋硅藻的一些屬的物種聚類分析和DNA條形碼鑒定。rbcL基因相對18S更加保守,但是并不能在高分類階元上進行硅藻的聚類分析,卻可以聚類異極藻屬、骨條藻屬、冠盤藻科和根管藻科等個別較低分類單位的物種序列。利用rDNA擴增子測序進行微藻群落中物種豐度的分析結(jié)果,以DNA為模板比以藻液為模板所構(gòu)建的克隆文庫檢測到的物種多,但都只檢測出少量物種并存在相同的物種擴增偏好性,且兩個文庫檢測到的物種的比例與樣本的細胞比例差異很大,一方面說明rDNA在不同硅藻物種中的拷貝數(shù)存在很大差異,另一方面說明rDNA構(gòu)建克隆文庫評估硅藻群落甚至真核微生物的組成結(jié)構(gòu)存在很大誤差。同時還檢測到在不同的硅藻培養(yǎng)物內(nèi)都存在ITS序列變異,但是變異程度很小(p0.013)。對拷貝數(shù)較少的核編碼的蛋白基因HSP90、elf2和actin基因設(shè)計通用引物并在8株甲藻中進行擴增和聚類分析,結(jié)果顯示actin基因在擴增率、序列可利用率和物種的區(qū)分能力上均顯示了一定的優(yōu)勢,基本上可以將甲藻在屬水平進行區(qū)分和聚類。甲藻混合樣本的actin基因克隆文庫的構(gòu)建和分析結(jié)果顯示,actin基因能夠?qū)?個物種全部檢出,序列與細胞的比例尚存在誤差,但在屬水平的誤差要小于種水平的誤差,物種檢出率高于rDNA,豐度偏差低于rDNA。采用Miseq測序?qū)?個模擬的硅藻和甲藻混合樣本分別進行了18S v9區(qū)和actin基因的測序分析結(jié)果顯示,rDNA擴增子測序進行微藻群落結(jié)構(gòu)分析的誤差很大,用18S rDNA擴增微藻群落容易受真菌等的影響；而actin基因的引物對甲藻的擴增具有特異性,actin可在屬水平上更接近地反應(yīng)群落實際的物種豐度,且能夠而更為準(zhǔn)確的反應(yīng)樣本間的聚類關(guān)系。故本文認為actin基因作為環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)中真核微生物群落結(jié)構(gòu)分析的分子標(biāo)記,比rDNA更具優(yōu)勢。
【關(guān)鍵詞】：DNA條形碼 硅藻 甲藻 rDNA actin Miseq測序 群落結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 第一章 文獻綜述14-33
• 1 海洋微藻14-17
• 1.1 海洋微藻的生態(tài)重要性14-15
• 1.2 海洋微藻的應(yīng)用價值15-16
• 1.3 經(jīng)典分類學(xué)對海洋微藻分類調(diào)查的不足16-17
• 2 微藻分類鑒定的分子方法17-25
• 2.1 DNA條形碼技術(shù)17-25
• 2.2 指紋圖譜法25
• 3 微藻群落結(jié)構(gòu)的研究方法25-28
• 3.1 擴增子測序法25-26
• 3.2 rDNA克隆文庫法存在的問題26-28
• 4 高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing)28-31
• 4.1 高通量測序簡介28-29
• 4.2 Miseq測序原理29-30
• 4.3 高通量測序技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用30-31
• 5 研究目的及意義31-33
• 第二章 海洋微藻DNA條形碼基因的評估33-55
• 0 引言33
• 1 實驗材料33-36
• 1.1 藻種來源33-34
• 1.2 實驗試劑34-35
• 1.3 實驗儀器與耗材35-36
• 2 實驗方法36-40
• 2.1 硅藻的分離純化和培養(yǎng)36
• 2.2 硅藻的形態(tài)鑒定36
• 2.3 硅藻18S和ITS rDNA、COI及rbcL通用引物的設(shè)計36-37
• 2.4 DNA的提取37-38
• 2.5 PCR擴增38
• 2.6 電泳檢測、測序38
• 2.7 部分序列的膠回收、克降和測序38-39
• 2.8 序列處理和分析39-40
• 3 實驗結(jié)果40-52
• 3.1 藻種的鑒定40-42
• 3.2 18S rDNA、ITS rDNA、COI、rbcL及UPA的擴增、測序以及比對42-43
• 3.3 18S rDNA、ITS rDNA、COI、rbcL和UPA的遺傳差異43-44
• 3.4 堿基替換飽和性分析44-45
• 3.5 18S、ITS、COI和rbcL的系統(tǒng)發(fā)育分析45-52
• 4 討論52-55
• 4.1 本文設(shè)計的引物的通用性52-53
• 4.2 硅藻核內(nèi)rDNA、線粒體和質(zhì)體基因的遺傳差異53
• 4.3 18S rDNA、ITS rDNA、rbcL和COI作為硅藻DNA條形碼的效力53-55
• 第三章 rDNA定量準(zhǔn)確性的評估55-65
• 0 引言55
• 1 實驗材料55-56
• 1.1 藻種來源55
• 1.2 實驗試劑55
• 1.3 實驗儀器與耗材55-56
• 2 實驗方法56-58
• 2.1 硅藻混合樣本的準(zhǔn)備56-57
• 2.2 總DNA的提取以及rDNA的PCR擴增、克隆和測序57
• 2.3 構(gòu)建硅藻ITS的DNA參考庫57-58
• 2.4 序列分析58
• 3 實驗結(jié)果58-62
• 3.1 選定的目標(biāo)藻株58-59
• 3.2 兩組數(shù)據(jù)產(chǎn)生的OTUs59-60
• 3.3 DD組和CD組的序列組成60-61
• 3.4 DD組和CD組ITS序列在物種內(nèi)的遺傳距離61
• 3.5 兩組混合樣本中各物種的序列數(shù)與細胞數(shù)61-62
• 4 討論62-65
• 第四章 甲藻定量基因的篩選65-78
• 0 引言65-66
• 1 實驗材料66
• 1.1 藻種及樣本信息66
• 1.2 實驗試劑66
• 2 實驗方法66-69
• 2.1 設(shè)計通用引物66-67
• 2.2 通用引物的驗證67
• 2.3 目的基因的篩選67-68
• 2.4 DNA參考庫的構(gòu)建68
• 2.5 甲藻混合樣本的制備與相應(yīng)克隆文庫的構(gòu)建68
• 2.6 克隆文庫的序列分析68-69
• 3 實驗結(jié)果69-75
• 3.1 HSP90、elf2和actin基因通用引物的擴增結(jié)果69-72
• 3.2 目的基因DNA參考庫的序列分析72-73
• 3.3 甲藻actin基因克隆文庫的OTUs計算73-74
• 3.4 各物種的actin序列數(shù)與其細胞量的比較74-75
• 4 討論75-78
• 4.1 Actin與elf2基因的比較75-76
• 4.2 Actin基因的定性和定量比例存在問題76-77
• 4.3 Actin基因與ITS的比較77-78
• 第五章 Miseq測序分析微藻群落的結(jié)構(gòu)組成78-105
• 0 引言78-79
• 1 實驗材料79-81
• 1.1 藻種來源79-80
• 1.2 實驗試劑80
• 1.3 實驗儀器與耗材80-81
• 2 實驗方法81-86
• 2.1 樣本的設(shè)置81-82
• 2.2 總DNA的提取82
• 2.3 全基因組擴增82
• 2.4 PCR擴增和產(chǎn)物的純化回收82-84
• 2.5 PCR-free文庫的構(gòu)建和上機測序84
• 2.6 Actin基因和18S v9區(qū)的DNA參考庫的構(gòu)建84
• 2.7 數(shù)據(jù)分析84-86
• 2.7.1 序列拼接和質(zhì)量過濾84-85
• 2.7.2 OTUs分析和物種注釋85
• 2.7.3 各樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)分析85
• 2.7.4 樣本的多樣性分析85-86
• 3 實驗結(jié)果86-100
• 3.1 7個模擬樣品的細胞組成86-87
• 3.2 Actin基因測序結(jié)果87-93
• 3.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計和質(zhì)控信息87-88
• 3.2.2 Actin樣本的組成結(jié)構(gòu)88-91
• 3.2.3 Actin樣本的多樣性91-93
• 3.3 18S v9區(qū)測序結(jié)果93-100
• 3.3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計和質(zhì)控信息93-94
• 3.3.2 18S v9樣本的組成結(jié)構(gòu)94-98
• 3.3.3 18S v9樣本的多樣性98-100
• 4 討論100-105
• 4.1 18S v9測序結(jié)果分析100-101
• 4.2 Actin基因測序結(jié)果分析101-102
• 4.3 18S v9和actin基因測序結(jié)果的比較102-103
• 4.4 全基因組擴增樣本分析103-105
• 參考文獻105-120
• 附錄120-122
• 致謝122-123
• 個人簡歷123
• 發(fā)表的學(xué)術(shù)論文123

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本文編號：813669