本文關(guān)鍵詞：糖苷水解酶與酯水解酶穩(wěn)定性和底物選擇性調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：以糖苷水解酶和酯水解酶為代表的水解酶類是重要的生物催化劑，在食品、飼料、洗滌、能源、醫(yī)藥、環(huán)境等行業(yè)均有重要應(yīng)用，約占全部酶制劑市場份額的80%以上。雖然目前對這些酶的催化機(jī)制研究已經(jīng)有了一定基礎(chǔ)，但是仍缺乏對控制酶的底物選擇性、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)因素的系統(tǒng)了解，使得對其進(jìn)行理性分子設(shè)計(jì)和改造的難度較大。通過X-ray晶體衍射方法解析的酶分子的三維結(jié)構(gòu)，為探究酶分子的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供精確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為改造現(xiàn)有酶分子提供線索和指導(dǎo)。在本論文中，我們基于前期酶學(xué)研究基礎(chǔ)，以結(jié)構(gòu)生物學(xué)為主要依托，針對幾類代表性糖苷水解酶和酯水解酶開展了以下研究： （1）嗜熱木聚糖酶CbXyn10B的系統(tǒng)酶學(xué)表征及其晶體結(jié)構(gòu)解析 木聚糖酶可高效水解-1,4-糖苷鍵，在木聚糖的降解和利用中有著重要的應(yīng)用潛力。我們克隆、表達(dá)和純化了Caldicellulosiruptor bescii中GH10家族的木聚糖酶CbXyn10B，性質(zhì)表征發(fā)現(xiàn)該酶具有較高的木聚糖水解活力（~450U/mg）、良好的熱穩(wěn)定性（60°C下的半衰期t1/2為7.7h）和pH穩(wěn)定性，并且對木聚糖顯示較高的底物專一性。為了進(jìn)一步探究CbXyn10B獨(dú)特功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們通過X-ray晶體衍射方法解析了CbXyn10B及其酶/底物復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)（分辨率為1.70-2.05），并與相關(guān)中溫酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，CbXyn10B呈現(xiàn)典型的(α/β)8-barrel結(jié)構(gòu)，其分子表面loop8上的Lys306和Arg314的側(cè)鏈，分別通過三個(gè)高度有序的水分子，在loop8的主鏈（Phe309和Pro310的羰基）和loop7的主鏈（Phe255、Asp257和Arg259的羰基）之間形成了相互交錯(cuò)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，這可能對于維持酶的穩(wěn)定性起到了關(guān)鍵作用；此外，在N-、C-末端之間存在著一系列緊密的相互作用：一方面由Tyr17、Phe20、Phe21和Phe337四個(gè)芳香族氨基酸組成了疏水堆疊簇，另一方面通過Phe20-Arg288和Lys16-Phe337-Arg285形成了Cation-π相互作用，這可能也對酶分子的穩(wěn)定起到了貢獻(xiàn)。我們通過丙氨酸掃描突變探測了這些推測的相互作用對酶穩(wěn)定性的影響，發(fā)現(xiàn)突變體K306A、R314A、F20A、F337A和F20A/F337A的熱穩(wěn)定性均明顯降低，證明了以上區(qū)域?qū)γ阜肿诱w穩(wěn)定性的關(guān)鍵作用。 （2）嗜熱木聚糖酶CbX的酶學(xué)性質(zhì)表征及其結(jié)構(gòu)域模塊功能的研究 GH11家族的木聚糖酶是目前研究較為充分的糖苷水解酶家族之一，該家族中許多成員均由催化結(jié)構(gòu)域（CD）和糖苷結(jié)合模塊結(jié)構(gòu)域（CBM）構(gòu)成。為了深入理解酶結(jié)構(gòu)模塊間的相互作用，我們克隆、表達(dá)和純化了嗜熱細(xì)菌C. bescii中GH11家族木聚糖酶CbXyn11A（以下簡稱為CbX），并構(gòu)建了其不同結(jié)構(gòu)模塊刪除的突變體，并對其進(jìn)行了系統(tǒng)的生化性質(zhì)研究。結(jié)果顯示，，CbX具有較高的催化活力（~2500U/mg）和良好的熱穩(wěn)定性（70°C下的t1/2為9.6h）；刪除其CBM模塊后獲得的突變體CbX-CDL和CbX-CD穩(wěn)定性比野生型提高了33倍和26倍，證明該模塊對于酶的穩(wěn)定性起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用；CbX-CD的C-末端比多數(shù)GH11家庭成員多出的5個(gè)氨基酸，將其刪除使酶的穩(wěn)定性大大減低（60倍）。結(jié)構(gòu)分析顯示，這5個(gè)氨基酸與鄰近反平行的β-片層上的氨基酸殘基形成多個(gè)氫鍵，從而穩(wěn)定了CbX-CD的結(jié)構(gòu)。這些關(guān)鍵信息有助于理解GH11家族木聚糖酶的穩(wěn)定性機(jī)制，為進(jìn)一步進(jìn)行分子改造奠定了基礎(chǔ)。 （3）嗜熱纖維二糖水解酶CbCBH48A的晶體結(jié)構(gòu)解析 GH48家族的纖維二糖水解酶能夠協(xié)同多種纖維素酶降解木質(zhì)纖維素，是生物質(zhì)資源利用體系的關(guān)鍵酶之一。但由于目前PDB數(shù)據(jù)庫中第48家族糖苷水解酶的結(jié)構(gòu)僅有5個(gè)，使得對其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的了解極為有限。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，C. bescii中的纖維二糖水解酶CbCBH48A具有良好的熱穩(wěn)定性，可以通過與C. bescii內(nèi)切纖維素酶CbCel9A和F. nodosum Rt17-B1內(nèi)切纖維素酶FnCel5A等協(xié)同作用，加速纖維素的水解。在此基礎(chǔ)上，我們解析了CbCBH48A及其酶與底物復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)（分辨率為1.70-2.00）。CbCBH48A整體結(jié)構(gòu)為(α/α)6-barrel，內(nèi)部螺旋N-末端的長loop形成一個(gè)分子內(nèi)部隧道和一個(gè)覆蓋在桶頂端的開放的裂隙區(qū)域，催化殘基位于表面裂隙和隧道區(qū)域交界處的凹槽內(nèi)。根據(jù)酶-底物復(fù)合物結(jié)構(gòu)推測，酶催化活性中心的Glu60作為質(zhì)子供體，Asp231作為質(zhì)子受體；底物分子纖維二糖和纖維四糖位于裂隙區(qū)域（產(chǎn)物釋放端），其非還原端朝向活性中心，暗示CbCBH48A是從纖維素的還原端向非還原端漸進(jìn)性地切割糖鏈。我們的工作豐富了該家族的結(jié)構(gòu)信息，有助于其結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的分析。 （4）嗜熱內(nèi)酯酶GkaP底物特異性調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 磷酸三酯酶（Phosphotriesterase, PTE）能夠高效地水解多種有機(jī)磷化合物，在有機(jī)磷污染物的脫毒、動(dòng)物有機(jī)磷中毒的預(yù)防治療以及有機(jī)磷化合物檢測的酶傳感器等方面有重要的應(yīng)用前景。嗜熱細(xì)菌G. kaustophilus HTA426類磷酸三酯酶的內(nèi)酯酶（Phosphotriesterase-like lactonase, PLL）GkaP不僅具有良好的熱穩(wěn)定性（80°C下的t1/2為8h），而且能夠非專一性的水解多種有機(jī)磷化合物。為探討該酶的底物選擇性機(jī)制，提高其對有機(jī)磷毒劑的水解活性，本實(shí)驗(yàn)室前期對其家族進(jìn)行了序列和結(jié)構(gòu)分析。發(fā)現(xiàn)位于GkaP活性中心的99位點(diǎn)可能在酶的底物特異性方面起關(guān)鍵作用。定點(diǎn)飽和突變獲得的突變體Y99L對對氧磷（paraoxon）的催化效率提高11倍，而對δ-癸內(nèi)酯（decalactone）的催化效率則降低15倍，底物選擇性產(chǎn)生了165倍的變化。為闡明這些突變體的構(gòu)效關(guān)系，我們解析了GkaP及其Y99L的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率分別為1.60和1.75。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，活性中心99位點(diǎn)可以調(diào)節(jié)活性位點(diǎn)表面loop7的閉合和開放構(gòu)象：在野生型GkaP中，99位點(diǎn)氨基酸為Tyr，loop7為閉合構(gòu)象；而在突變體Y99L中，loop7則偏離活性中心6.6-8.6，為開放構(gòu)象，擴(kuò)大了底物結(jié)合口袋，有利于對氧磷底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放，從而加快反應(yīng)速率。 （5）脂肪酶CalB熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 南極假絲酵母的脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CalB）具有嚴(yán)格的立體選擇性，是目前在精細(xì)化工方面應(yīng)用的最為廣泛的脂肪酶之一。然而，CalB較低的熱穩(wěn)定性成為限制其廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵瓶頸之一。本實(shí)驗(yàn)室前期通過酶活性中心穩(wěn)定化的策略，對CalB活性中心區(qū)域柔性較大的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)飽和突變，獲得了D223G，L278M和D223G/L278M三個(gè)突變體，其在48°C的半衰期分別較野生型提高了3倍、6倍和13倍。為了研究以上突變體熱穩(wěn)定性提高的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，我們解析了CalB和突變體D223G，L278M，D223G/L278M的晶體結(jié)構(gòu)（1.50-1.60），發(fā)現(xiàn)在突變體D223G/L278M中，位于活性中心的α10螺旋上形成了一個(gè)連續(xù)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)，增強(qiáng)了α10螺旋剛性，提升了活性中心底物結(jié)合部位的剛性，從而提升酶的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。為進(jìn)行酶分子的熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性改造提供了新的途徑。
【關(guān)鍵詞】：木聚糖酶 纖維素酶 磷酸三酯酶 脂肪酶 X-ray晶體結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系 熱穩(wěn)定性 酶分子改造
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 第一章 前言15-41
• 1.1 糖苷水解酶簡介15-29
• 1.1.1 木聚糖和木聚糖酶16-24
• 1.1.2 纖維素和纖維素酶24-29
• 1.2 酯水解酶簡介29-35
• 1.2.1 類磷酸三酯酶的內(nèi)酯酶29-33
• 1.2.2 脂肪酶33-35
• 1.3 主要研究方法介紹35-38
• 1.3.1 X-ray 衍射晶體學(xué)35-36
• 1.3.2 同源建模36
• 1.3.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬36-37
• 1.3.4 分子對接37
• 1.3.5 差示熱量掃描37
• 1.3.6 等溫量熱滴定37-38
• 1.4 立題依據(jù)38-41
• 第二章 嗜熱木聚糖酶 CbXyn10B 的克隆、表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)表征及晶體結(jié)構(gòu)解析41-87
• 2.1 引言41
• 2.2 材料和試劑41-45
• 2.2.1 菌株和質(zhì)粒41-42
• 2.2.2 主要試劑42
• 2.2.3 主要軟件42
• 2.2.4 主要儀器42-43
• 2.2.5 溶液配制43-45
• 2.2.6 常用培養(yǎng)基45
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法45-53
• 2.3.1 CbXyn10B 的序列分析45
• 2.3.2 CbXyn10B 及其突變體的構(gòu)建45-47
• 2.3.3 CbXyn10B 的表達(dá)和純化47-48
• 2.3.4 活力測定48-49
• 2.3.5 定點(diǎn)飽和突變庫的篩選49-50
• 2.3.6 CbXyn10B 的基本酶學(xué)性質(zhì)表征50-51
• 2.3.7 CbXyn10B 及其突變體的熱力學(xué)穩(wěn)定性分析51
• 2.3.8 CbXyn10B 晶體的制備與儲(chǔ)存51-52
• 2.3.9 晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和三維結(jié)構(gòu)的解析52-53
• 2.3.10 分子動(dòng)力學(xué)模擬53
• 2.4 結(jié)果與分析53-85
• 2.4.1 CbXyn10B 的序列分析53-55
• 2.4.2 CbXyn10B 的表達(dá)與純化55-56
• 2.4.3 CbXyn10B 酶學(xué)性質(zhì)表征56-65
• 2.4.4 CbXyn10B 及其酶-底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析65-72
• 2.4.5 CbXyn10B 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的因素72-82
• 2.4.6 CbXyn10B 活性中心+2 亞位點(diǎn)的功能研究82-85
• 2.5 小結(jié)85-87
• 第三章 嗜熱木聚糖酶 CbX 的克隆、表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)表征及其結(jié)構(gòu)域模塊功能的研究87-103
• 3.1 引言87-88
• 3.2 材料和試劑88
• 3.2.1 菌株和質(zhì)粒88
• 3.2.2 主要試劑88
• 3.2.3 主要儀器88
• 3.2.4 溶液配制88
• 3.2.5 常用培養(yǎng)基88
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法88-93
• 3.3.1 CbX 的結(jié)構(gòu)序列分析88-89
• 3.3.2 CbX 及其截短突變體重組質(zhì)粒的構(gòu)建89-91
• 3.3.3 CbX 及其截短突變體的表達(dá)與純化91
• 3.3.4 活力測定91-92
• 3.3.5 CbX 及其截短突變體的基本酶學(xué)性質(zhì)表征92
• 3.3.6 CbX 及其截短突變體的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性測定92
• 3.3.7 CbX 及其截短突變體的熱力學(xué)穩(wěn)定性測定92-93
• 3.3.8 CbX 及其截短突變體的表觀動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定93
• 3.3.9 等溫量熱滴定93
• 3.4 結(jié)果與分析93-102
• 3.4.1 CbX 的結(jié)構(gòu)序列分析93-96
• 3.4.2 CbX 及其截短突變體的表達(dá)與純化96
• 3.4.3 CbX 及其截短突變體的基本酶學(xué)性質(zhì)表征96-98
• 3.4.4 CbX 及其截短突變體的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性98-99
• 3.4.5 CbX 及其截短突變體的熱力學(xué)穩(wěn)定性99-100
• 3.4.6 CbX 及其截短突變體表觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)比較100-101
• 3.4.7 CbX-CBM 的功能101-102
• 3.5 小結(jié)102-103
• 第四章 嗜熱纖維二糖水解酶 CbCBH48A 的晶體結(jié)構(gòu)解析103-113
• 4.1 引言103
• 4.2 CbCBH48A 的表達(dá)與純化103-104
• 4.3 CbCBH48A 晶體的制備和衍射數(shù)據(jù)的收集與處理104-105
• 4.4 CbCBH48A 結(jié)構(gòu)模型的搭建和質(zhì)量評估105-106
• 4.5 CbCBH48A 及其酶-底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析106-111
• 4.5.1 CbCBH48A 的整體結(jié)構(gòu)106-107
• 4.5.2 CbCBH48A 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)107-108
• 4.5.3 CbCBH48A 與同家族成員的結(jié)構(gòu)比較108-111
• 4.6 小結(jié)111-113
• 第五章 嗜熱內(nèi)酯酶 GkaP 底物特異性調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)113-121
• 5.1 引言113
• 5.2 GkaP 和突變體 Y99L 的底物特異性分析113-114
• 5.3 GkaP 和突變體 Y99L 的表達(dá)與純化114-115
• 5.4 GkaP 和突變體 Y99L 晶體的制備和衍射數(shù)據(jù)的收集與處理115-116
• 5.5 GkaP 和突變體 Y99L 結(jié)構(gòu)模型的的搭建和質(zhì)量評估116-117
• 5.6 99 位點(diǎn)氨基酸影響 GkaP 底物特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)117-119
• 5.7 小結(jié)119-121
• 第六章 脂肪酶 CalB 熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性調(diào)控的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)121-129
• 6.1 引言121
• 6.2 CalB 和突變體 D223G/L278M 的熱穩(wěn)定性研究121-122
• 6.3 CalB 及其突變體的表達(dá)與純化122-123
• 6.4 CalB 及其突變體晶體的制備和衍射數(shù)據(jù)的收集與處理123
• 6.5 CalB 及其突變體結(jié)構(gòu)模型的的搭建和質(zhì)量評估123-125
• 6.6 CalB 活性中心的剛性與酶的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性125-127
• 6.7 小結(jié)127-129
• 附錄Ⅰ129-130
• 附錄Ⅱ130-131
• 附錄Ⅲ131-132
• 附錄Ⅳ132-133
• 創(chuàng)新點(diǎn)133-135
• 展望135-137
• 作者簡介137
• 攻讀博士期間取得的科研成果137-138
• 參與的科研課題138-139
• 致謝139-141
• 參考文獻(xiàn)141-152

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張寧寧;林白雪;何柳;余能富;劉斌;謝聯(lián)輝;;降解半纖維素嗜熱菌的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)[J];福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2010年05期

2 熊亞紅;蘇健鴻;劉小平;;修飾脂肪酶催化水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)研究[J];分子催化;2010年05期

3 章素平;柳志強(qiáng);鄭裕國;;南極假絲酵母脂肪酶B的修飾與改造[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2011年02期

4 舒正玉;王愛玲;楊江科;閆云君;;提高微生物脂肪酶產(chǎn)量、活性和穩(wěn)定性的方法研究[J];工業(yè)微生物;2007年03期

5 柯飛;王海闊;何成飛;王峗;趙安芳;;產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化[J];廣州化工;2014年01期

6 付顯鋒;鄭建永;應(yīng)向賢;鄢洪德;汪釗;;紫外分光光度法表征Lipozyme TL IM脂肪酶轉(zhuǎn)酯化活性(英文)[J];催化學(xué)報(bào);2014年04期

7 黎小軍;謝蓮萍;劉建宏;朱婷婷;劉蓉;;產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選、鑒定與產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J];江西師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2014年01期

8 李振東;陳秀蓉;楊成德;李鵬;;線葉嵩草內(nèi)生產(chǎn)纖維素酶細(xì)菌分離及初步鑒定[J];草業(yè)科學(xué);2014年01期

9 李友杰;張振華;謝彬;于世峰;李金媛;楊鵬;李洪珠;鞏江;倪士峰;;甘蔗養(yǎng)生價(jià)值探析[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年05期

10 陳燕;裴建新;郭媛;林麗華;黃日波;龐浩;;陰溝腸桿菌一個(gè)內(nèi)切纖維素酶Cel8A的克隆和功能證實(shí)[J];廣西科學(xué);2014年01期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Ryan Bell;John Noakes;Tim Short;;Community structure of archaea in the water column above gas hydrates in the Gulf of Mexico[A];2008年中國微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

2 林信一;杝家浩;;pH\ o盞氐乃參飭U理和能源回收影

本文編號：477812