隨著“后基因組時代”的到來,一方面功能基因組學研究基因間相互作用、代謝調控網(wǎng)絡的需求日益迫切,另一方面在植物生長發(fā)育過程中遺傳冗余卻大量存在,這種情況下,只有同時敲除多個基因或位點才能獲得特定的能顯現(xiàn)的表型,以達到為功能基因組學研究、遺傳育種提供素材的目的。盡管隨著基因組編輯技術的發(fā)展,近幾年來在植株水平,對單個基因或同時對兩個位點進行敲除編輯已經(jīng)實現(xiàn),但是如若想獲得多個基因同時突變且穩(wěn)定遺傳的突變體,按照傳統(tǒng)雜交育種思路,不但累加突變并純合化的過程極為耗時,而且當突變基因個數(shù)增長到一定數(shù)量時,雜交后基因型檢測的工作量之大也是難以承受的。除此之外,多個位點的同時敲除,對于像小麥、燕麥、煙草、棉花等多倍體植物的研究也非常有意義。盡管多基因/多位點同時敲除意義重大,雖然利用鋅指蛋白酶、TALEN等基因組編輯技術于幾年前實現(xiàn)了植物中單個基因的敲除,但是因為技術自身的局限性,植物中多基因敲除在整個植物學界進展緩慢。在我們TALEN基因組編輯技術應用成功后,改造用于多基因敲除TALEN技術的課題陷入僵局時,CRISPR/Cas9技術應運而生,因為CRISPR/Cas9系統(tǒng)含有轉錄后相互獨立的Ca... 

【文章來源】：重慶大學重慶市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

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縮略詞
1 引言
    1.1 植物基因組與功能基因組學研究基礎
        1.1.1 立足全基因組水平、注重多基因間相互作用的“后基因組時代”
        1.1.2 植物功能基因組研究的主要技術方法及其特點
    1.2 基因組定點編輯技術的發(fā)展及其應用前景
        1.2.1 鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）
        1.2.2 類轉錄激活效應因子核酸酶（TALEN）
        1.2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng) （Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR associated systems）
        1.2.4 基因組編輯技術的比較與CRISPR/Cas9在多基因敲除中的優(yōu)勢
    1.3 單基因敲除、大片段刪除及多個基因同時敲除策略
        1.3.1 單個基因完全功能敲除
        1.3.2 基因組大片段刪除
        1.3.3 同一個體中多基因同時敲除
    1.4 突變體靶位點篩選方法比較
    1.5 用于基因組編輯技術的植物（擬南芥、番茄）轉化方法及檢測時期
    1.6 基因組編輯植物的生物安全性
    1.7 研究意義及立題依據(jù)
    1.8 本研究的技術路線
2 CRISPR／CAS9系統(tǒng)介導的擬南芥IDM3單個基因編輯敲除及IDM3參與去甲基化過程的研究
    2.1 材料與方法
        2.1.1 CRISPR／Cas9系統(tǒng)sg RNA的設計與表達載體的組裝
        2.1.2 轉基因及轉基因陽性植株篩選
        2.1.3 突變體的篩選與鑒定
        2.1.4 Chop-PCR檢測idm3突變體的甲基化程度
    2.2 結果與討論
        2.2.1 轉基因個體及成功敲除個體的篩選
        2.2.2 IDM3促進擬南芥的去甲基化過程
    2.3 小結
3 運用CRISPR /CAS9系統(tǒng)通過基因組長片段刪除敲除單個基因
    3.1 材料與方法
        3.1.1 用于長片段刪除的sg RNAs設計與表達載體組裝
        3.1.2 轉基因及轉基因陽性植株的篩選
        3.1.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的擬南芥基因組長片段刪除
    3.2 結果與討論
        3.2.1 T1代AFLP檢測篩選及測序結果
        3.2.2 T2代大片段刪除檢測及穩(wěn)定株系的獲得
    3.3 小結
4 擬南芥PYL基因家族多基因敲除突變體庫的構建與基因功能初步研究
    4.1 材料與方法
        4.1.1 擬南芥PYLs多基因敲除sg RNA設計與表達載體組裝
        4.1.2 轉化植株及PYLs多基因突變體庫篩選方法
    4.2 結果與討論
        4.2.1 轉基因及多基因敲除個體的篩選
        4.2.2 T2純合多基因突變體的獲得及表型和基因功能初步分析
    4.3 小結
5 CRISPR/CAS9系統(tǒng)的廣適性驗證
    5.1 材料與方法
        5.1.1 用于番茄基因敲除的sg RNA設計與表達載體組裝
        5.1.2 番茄組織培養(yǎng)轉化與誘導成苗
    5.2 結果與討論
        5.2.1 轉基因個體及成功敲除個體的篩選
    5.3 小結
6 總結與展望
7 創(chuàng)新點
致謝
參考文獻
附錄1
    A. 博士期間發(fā)表及待發(fā)表的文章
附錄2
    A. 文中涉及關鍵基因或原件的序列
    B. 文中所用部分引物


【參考文獻】：
期刊論文
[1]DNA甲基化與基因表達調控研究進展[J]. 史玉杰,李慶賀,劉曉輝.  中國生物工程雜志. 2013(07)
[2]RNAi機制及在植物中應用的研究概述[J]. 崔喜艷,孫小杰,劉忠野,張繼偉.  吉林農(nóng)業(yè)大學學報. 2013(02)
[3]水稻功能基因圖位克隆研究進展[J]. 童繼平,劉學軍,韓傲男,馬忠友,劉敏.  中國生物工程雜志. 2012(03)
[4]我國轉基因植物研發(fā)形勢及發(fā)展戰(zhàn)略[J]. 萬建民.  生命科學. 2011(02)
[5]植物RNAi的特點及其應用研究進展[J]. 白描,楊國順,陳石,張美玲.  生物技術通報. 2009(08)
[6]反向遺傳學在現(xiàn)代生物學領域中的應用[J]. 楊宇,王丹,李浩戈.  生物技術通報. 2009(05)
[7]功能基因組學的研究內(nèi)容與方法[J]. 趙劍華,王秀琴,劉芝華,吳.  生物化學與生物物理進展. 2000(01)



本文編號：3008477