發(fā)布時(shí)間：2020-07-29 09:52

【摘要】：背景：內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是最近在哺乳動(dòng)物血液循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的一群表達(dá)CD133、CD31、CD34和VEGFR-2的細(xì)胞。越來越多的證據(jù)表明內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管損傷的修復(fù)和病理學(xué)的新血管形成過程中起重要作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞失衡與許多心血管疾病有關(guān),包括人類的肺動(dòng)脈高壓(PAH)。叢狀病變是PAH病情惡化的特征,指癥為不良預(yù)后。最近的研究指出患有嚴(yán)重PAH的病人的血液中內(nèi)皮祖細(xì)胞增多,帶有叢狀病變的EPCs來源于血液循環(huán)中的EPCs,說明這些細(xì)胞與血管再生有關(guān)。然而,其中的機(jī)制尚不明確。雞的PAH與人類的病情有部分相似之處,包括管壁內(nèi)側(cè)肥厚,內(nèi)膜增殖,及肺血管中閉合的叢狀病變,所以它被認(rèn)為是研究人類肺動(dòng)脈高壓的理想模型。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在叢狀病變中有長期的炎癥反應(yīng)和HGF的增長性表達(dá),然而其中的機(jī)理尚未完全清晰。叢狀病變表現(xiàn)為管腔中出現(xiàn)圓形或裂隙狀的區(qū)域,主要被內(nèi)皮樣細(xì)胞填充,也就是EPCs。叢狀病變區(qū)域被T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等慢性炎癥細(xì)胞包圍。另外,炎癥主要集中于動(dòng)脈病變附近。前期的研究表明由淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子TNF-a,可以降低細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附和EPCs的成小管能力。我們假設(shè)與淋巴細(xì)胞的共培養(yǎng)可以導(dǎo)致EPCs的功能紊亂,這可以解釋叢狀病變中的EPCs維持未分化狀態(tài)不發(fā)育為內(nèi)皮細(xì)胞。本研究的主要目的是研究禽類中EPCs的特點(diǎn),研究HGF在炎癥期間對EPC功能的影響,特別是EPCs對PAH中叢狀病變產(chǎn)生的影響。目前還沒有此類研究對禽類的骨髓進(jìn)行培養(yǎng),研究其表型特征,比較外周血單核細(xì)胞和骨髓單核細(xì)胞體外培養(yǎng)的血管再生能力和病理情況下HGF對EPCs的作用。我們主要做了三個(gè)方面的實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)1比較雞骨髓誘導(dǎo)的單核細(xì)胞在EGM-2和DMEM培養(yǎng)基中的分化特征,用于比較誘導(dǎo)自這兩種培養(yǎng)基的內(nèi)皮祖細(xì)胞有怎樣的生物性狀差異,同時(shí)衡量這兩種培養(yǎng)基對體外培養(yǎng)來自雞骨髓的具有血管再生潛能的內(nèi)皮祖細(xì)胞的效價(jià)。骨髓誘導(dǎo)的單核細(xì)胞始終為紡錘樣結(jié)構(gòu),表達(dá)CD133、CD31和VEGFR-2。Dil-ac-LDL/FITC-UEA-1雙陽性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示組間無顯著差異。培養(yǎng)于EGM-2的BMMNCs能形成管狀結(jié)構(gòu),然而培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞則不能形成這樣的結(jié)構(gòu)。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)EGM-2更利于EPCs的誘導(dǎo)增殖因?yàn)樗苁辜?xì)胞離體培養(yǎng)后增殖,有利于內(nèi)皮分化,遷移,提高細(xì)胞體外血管再生能力。而DMEM有利于細(xì)胞早期形態(tài)分化,但不支持內(nèi)皮分化,遷移及血管再生能力。通過觀察兩種培養(yǎng)基對雞骨髓誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞,我們更進(jìn)一步觀察到來自快速生長型肉雞骨髓和外周血分離誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞表型和體外培養(yǎng)血管再生能力有差異。PBMNCs具有特征性的內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài),最初出現(xiàn)的紡錘樣結(jié)構(gòu),而后呈現(xiàn)為鋪路石狀,而BMMNCs自始至終都為紡錘狀結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)自兩種來源的細(xì)胞均表達(dá)CD133、CD31和VEGFR-2,而PBMNCs誘導(dǎo)的細(xì)胞CD133表達(dá)量降低。而Dil-ac-LDL/lectin雙陽性細(xì)胞統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩組沒有差異。誘導(dǎo)自BMMNCs的細(xì)胞具有成脂細(xì)胞及成骨細(xì)胞能力。誘導(dǎo)自PBMNC的細(xì)胞在Matrigel中培養(yǎng)能形成管狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),但BMMNC分離的細(xì)胞只形成了少量管狀結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明自BMMN分離的細(xì)胞并不是”真”的EPC,這與前期在哺乳類動(dòng)物上的發(fā)現(xiàn)骨髓可能不是EPCs最好的分離來源相一致。最后,我們研究了肝細(xì)胞生長因子(HGF)對暴露于淋巴細(xì)胞的EPCs功能的影響。通過內(nèi)皮細(xì)胞特異的ac-LDL吞噬和lectin結(jié)合實(shí)驗(yàn)來確定細(xì)胞為EPCs。最后,用HGF/淋巴細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合刺激EPCs,將EPCs用0.25%的trypsin-EDTA消化后用于實(shí)驗(yàn)。采用雞外周血中暴露于淋巴細(xì)胞的EPCs來檢測內(nèi)源的HGF。5-7天時(shí)紡錘樣細(xì)胞形成小集落簇在第10天左右分化成為鋪路石樣的單層細(xì)胞。與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)的EPCs的增殖性較普通培養(yǎng)沒有明顯差異,說明僅與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)不會(huì)影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖。有趣的是,當(dāng)HGF對EPCs的作用濃度為5ng/ml和lOng/ml時(shí),EPCs的增殖被顯著抑制,但當(dāng)用20ng/ml時(shí),細(xì)胞增殖顯著高。在普通培養(yǎng)基中約17.2%的EPCs凋亡,加入了5、10、 20ng/ml的HGF能抑制細(xì)胞的死亡。當(dāng)EPC與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)也可以看到細(xì)胞凋亡顯著下降,提示HGF和淋巴細(xì)胞能顯著抑制EPC的凋亡。將HGF與淋巴細(xì)胞聯(lián)合刺激EPC能更有效的抑制它的凋亡。5ng/ml HGF對暴露于淋巴細(xì)胞的EPCs的凋亡有顯著的抑制作用。高濃度(20ng/ml)的HGF顯著提高細(xì)胞遷移能力而對細(xì)胞增殖有相同的作用�？偠灾�,暴露于淋巴細(xì)胞能顯著提高細(xì)胞的遷移能力。同樣的,低濃度HGF(5ng/ml)單獨(dú)或聯(lián)合淋巴細(xì)胞均顯著提高細(xì)胞遷移能力,提示HGF和淋巴細(xì)胞在最低濃度是也有協(xié)同作用。量,動(dòng)員能力,減少細(xì)胞死亡,HGF能明顯抑制細(xì)胞凋亡,從而提高暴露于淋巴細(xì)胞的EPCs的細(xì)胞存活能力,所以HGF能提高EPCs的數(shù)量,減少細(xì)胞死亡,促進(jìn)在血管損傷部位和叢狀病變部位管狀結(jié)構(gòu)的形成。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q813;S852.3

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Therapeutic neovascularization by autologous transplantation with expanded endothelial progenitor cells from peripheral blood into ischemic hind limbs[J];Acta Pharmacologica Sinica;2005年09期

本文編號：2773795