【摘要】：長期以來,人們一直認(rèn)為輻射的損傷效應(yīng)僅僅存在于被輻照的細(xì)胞,而隨著輻射旁效應(yīng)的發(fā)現(xiàn),在非輻照細(xì)胞出現(xiàn)與照射細(xì)胞類似的生物學(xué)效應(yīng),對傳統(tǒng)的輻射致癌危險(xiǎn)性的線性模型以及輻射防護(hù)措施提出新的挑戰(zhàn)。輻射旁效應(yīng)成為目前國際上輻射生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,涉及到輻射損傷信號(hào)的產(chǎn)生、傳導(dǎo)和響應(yīng),以及信號(hào)的級聯(lián)放大過程。目前,盡管輻射旁效應(yīng)的現(xiàn)象已經(jīng)被明確,但是對于輻射損傷信號(hào)在不同組織中傳遞的差異還不清楚。相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是如何參與到輻射旁效應(yīng)的過程中的,也還沒有被闡明。因此,發(fā)展新的輻射技術(shù),將研究體系從離體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到活體水平,在更為精確的條件下分析和研究低劑量輻射的生物學(xué)反應(yīng),解析其重要的生物學(xué)機(jī)制,對于輻射防護(hù)和腫瘤治療具有重要意義。本研究基于中國科學(xué)院離子束生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的單粒子微束裝置和模式生物秀麗隱桿線蟲,定點(diǎn)輻射線蟲的消化器官后食道球中心和生殖器官陰門部位,研究了輻射旁效應(yīng)信號(hào)在生殖系統(tǒng)內(nèi)部傳遞和從消化系統(tǒng)向生殖系統(tǒng)傳遞的區(qū)別,并探索其內(nèi)在的分子機(jī)制。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.通過CAS-LIBB單粒子微束裝置以3.2 MeV的質(zhì)子對線蟲的咽部后食道球中心和陰門部位進(jìn)行定點(diǎn)定量輻照,結(jié)果表明,系統(tǒng)內(nèi)和系統(tǒng)間的輻射都可以導(dǎo)致輻射旁效應(yīng),與輻射食道球的結(jié)果相比,對線蟲的陰門部位進(jìn)行定點(diǎn)輻射時(shí),生殖腺細(xì)胞凋亡數(shù)目更加顯著,說明輻射旁效應(yīng)信號(hào)更容易在生殖系統(tǒng)內(nèi)部傳遞。不同的組織對輻射表現(xiàn)出不同的敏感性,因此導(dǎo)致了輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的差別。并且輻射損傷信號(hào)在生殖系統(tǒng)內(nèi)部轉(zhuǎn)導(dǎo)會(huì)引發(fā)更嚴(yán)重的遺傳損傷效應(yīng),導(dǎo)致線蟲生殖腺細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性。2.通過對HUS-1::CFP熒光報(bào)告品系的應(yīng)用,我們觀察到定點(diǎn)輻射咽部和陰門部位后,旁區(qū)生殖細(xì)胞中熒光聚點(diǎn)的產(chǎn)生,直接證明了活體水平輻射旁效應(yīng)導(dǎo)致的DNA損傷的發(fā)生。與此同時(shí),對熒光聚點(diǎn)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)顯示了兩種類型的輻射旁效應(yīng)導(dǎo)致的損傷程度的區(qū)別,即生殖系統(tǒng)內(nèi)部的輻射旁效應(yīng)比從消化系統(tǒng)到生殖系統(tǒng)這種系統(tǒng)間的輻射旁效應(yīng)導(dǎo)致的損傷要更加嚴(yán)重,這與其他的生物學(xué)檢測終點(diǎn)所反映的結(jié)論也是一致的。線蟲單基因突變品系hus-1(op241、cep-1(w40)、egl-1(n487)、ced-4(nU162)、ced-3(n717)的使用和全身性 RNA 干擾mrt-2、hus-1、cep-1、ced-4這四個(gè)基因,證明DDR途徑對于輻射誘導(dǎo)的旁區(qū)生殖腺細(xì)胞調(diào)亡來說是必不可少的。3.為了進(jìn)一步確定DDR途徑的空間功能,我們利用rrf-1和ppw-1線蟲突變品系對DDR途徑的關(guān)鍵基因進(jìn)行組織特異性RNA干擾。結(jié)果表明,mrt-2/hus-1/cep-1/ced-4主要在輻射旁效應(yīng)的響應(yīng)階段起作用。與系統(tǒng)內(nèi)輻射損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不需要體細(xì)胞內(nèi)的DDR成分相比,在輻射損傷信號(hào)從后食道球向生殖細(xì)胞傳遞時(shí),體細(xì)胞組織中的DNA損傷檢查點(diǎn)MRT-2和HUS-1對系統(tǒng)間輻射導(dǎo)致的生殖細(xì)胞凋亡起到部分作用。但總體來看,DDR途徑主要還是在輻射旁效應(yīng)的響應(yīng)階段起作用的。4.為了研究輻射后線蟲全身的ROS表達(dá)水平,我們使用了 GFP標(biāo)記的線粒體錳超氧化物歧化酶SOD-3表達(dá)和線粒體的解折疊蛋白反應(yīng)的兩個(gè)熒光報(bào)告品系CF1553和SJ4100,以及分子探針H2DCF-DA。結(jié)果顯示兩個(gè)位點(diǎn)的輻射都能導(dǎo)致線蟲全身性ROS水平的上升,輻射位點(diǎn)的咽部和陰門部位可以觀察到局部ROS增強(qiáng),而通過自由基猝滅劑DMSO處理,可以恢復(fù)旁區(qū)生殖細(xì)胞的凋亡水平,表明氧化損傷在輻射旁效應(yīng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用。5.初步證明了該過程涉及神經(jīng)酰胺的參與以及神經(jīng)酰胺與DDR通路的關(guān)聯(lián)。神經(jīng)酰胺合酶功能的缺失能有效抑制輻射旁效應(yīng)誘導(dǎo)的生殖細(xì)胞凋亡,因?yàn)闊o論是lagr-1(gk327和hyl-1(ok976)基因單突變,還是lagr-1(gk327),hyl-1(ok976)基因雙突變品系,線蟲的生殖腺細(xì)胞凋亡都被明顯抑制,而sphk-1(0k1097)基因突變品系并沒有導(dǎo)致生殖腺細(xì)胞凋亡發(fā)生明顯的變化,表明神經(jīng)酰胺生物合成通路參與了線蟲輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的誘導(dǎo)。在對神經(jīng)酰胺代謝合酶基因功能缺失后egl-1/ced-13基因mRNA水平表達(dá)量的變化進(jìn)行探究,結(jié)果表明神經(jīng)酰胺和CEP-1可能平行地對輻射誘導(dǎo)的生殖腺細(xì)胞凋亡起協(xié)同作用。
[Abstract]:For a long time, it has been thought that radiation damage effects exist only in irradiated cells. With the discovery of radiation side effects, biological effects similar to those of irradiated cells appear in non-irradiated cells, which pose new challenges to traditional linear models of radiation-induced cancer risk and radiation protection measures. One of the hotspots in the field of radiation biology is the generation, transmission and response of radiation damage signals, and the cascade amplification of signals. Therefore, the development of new radiation technologies, the transfer of research systems from cells in vitro to living levels, the analysis and study of biological responses to low-dose radiation under more precise conditions, and the analysis of their important biological mechanisms for radiation protection and cancer treatment, have not been clarified. This study was based on the single-particle microbeam system and the model organism Cryptococcus elegans in the Key Laboratory of Ion Beam Biology, Chinese Academy of Sciences. The signal transduction from the digestive system to the genital system was studied at the posterior esophageal bulb center and the vaginal hilum of the genital organs. The main results of this paper are as follows: 1. Cas-LIBB single-particle microbeam irradiation with 3.2 MeV protons on the posterior esophageal sphere and the vagina of the nematode pharynx was carried out. The results showed that both intra-system and inter-system radiation could cause radiation para-radiation. The number of apoptotic cells in the genital glands of nematodes exposed to fixed-point irradiation was more significant than that of the esophageal bulb irradiation, suggesting that bystander effect signals were more easily transmitted within the reproductive system. Transduction of radiation damage signals in the reproductive system can lead to more serious genetic damage, leading to genomic instability in the gonad cells of nematodes. 2. By applying HUS-1:: CFP fluorescent reporter strain, we observed the production of fluorescent aggregates in the germ cells of the parapharynx and the vagina after fixed-point radiation, which directly proved the existence of fluorescent aggregates in living cells. At the same time, statistics on the number of fluorescent foci show the difference in the degree of damage caused by two types of radiation-induced side effects, i.e. the radiation-induced side effects in the reproductive system are more severe than those caused by the radiation-induced side effects between the digestive and reproductive systems. This is also consistent with other biological endpoints. The use of single-gene mutations hus-1 (op241, CEP-1 (w40), egl-1 (n487), CED-4 (nU162), CED-3 (n717) and systemic RNA interference with mrt-2, hus-1, cep-1, CED-4 in nematode prove that the DDR pathway is involved in radiation-induced paragonadal apoptosis. 3. In order to further determine the spatial function of DDR pathway, we used rrf-1 and ppw-1 nematode mutant strains to interfere with the key genes of DDR pathway with tissue-specific RNA. The results showed that mrt-2/hus-1/cep-1/ced-4 played a major role in the response phase of radiation side effects. No body was required for signal transduction of radiation damage in the system. Compared with intracellular DDR components, DNA damage checkpoints MRT-2 and HUS-1 in somatic tissues partially contribute to the apoptosis of germ cells induced by inter-system radiation when radiation damage signals are transmitted from the posterior esophageal bulb to the germ cells. Two fluorescent reporting strains CF1553, SJ4100 and molecular probe H2DCF-DA were used to study the ROS expression in nematode whole body after irradiation. The results showed that both of them could induce the increase of ROS level in nematode whole body. Local ROS enhancement was observed in the pharynx and the vagina of the radiation site, and the apoptosis level of the germ cells in the para-region was restored by DMSO treatment, indicating that oxidative damage plays a key role in the transduction of radiation-induced side effects. 5. It was preliminarily proved that ceramide and ceramide-DDR pathway are involved in this process. The deletion of ceramide synthase function can effectively inhibit the apoptosis of germ cells induced by bystander effect, because the apoptosis of germ cells in nematodes is inhibited by either single mutation of lagr-1 (gk327 and hyl-1 (ok976) gene or double mutation of lagr-1 (gk327) and hyl-1 (ok976) gene, while the apoptosis of germ cells in nematodes is inhibited by sphk-1 (0k1097) gene mutation. There was no significant change in the apoptosis of gonad cells, suggesting that ceramide biosynthetic pathway was involved in the induction of radiation-induced bystander effects in nematodes. It has synergistic effect on radiation induced apoptosis of gonadal cells.
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q691

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本文編號(hào)：2180158