本文選題：棉鈴蟲 + 中腸��； 參考：《山東大學》2017年博士論文

【摘要】：研究背景及存在的科學問題程序性細胞死亡(PCD)主要包括有自噬和凋亡。自噬是指當細胞受到壓力或營養(yǎng)缺乏時,細胞將自身的一些損傷蛋白或細胞器降解掉從而產生能量讓自己存活下來的過程。凋亡是指機體通過自身基因及其產物主動而有序的調控機體死亡的過程,稱為Ⅰ型PCD。對于自噬的功能目前主要存在兩種觀點:一種是自噬導致細胞存活,在眾多的哺乳動物細胞中,如在人類的成纖維和T細胞中,自噬是一種存活過程。另一種是自噬是一種死亡過程,既Ⅱ型PCD,如在果蠅中腸的降解。因此,自噬究竟是存活還是死亡、自噬與凋亡之間究竟存在著一種什么關系以及自噬轉向凋亡的分子機制是當今亟待解決的科學問題。昆蟲在經歷幼蟲到蛹的轉變過程中,舊的中腸會發(fā)生PCD降解,包括自噬與凋亡,因此昆蟲中腸PCD為研究自噬和凋亡以及二者的關系提供了理想模型。雙翅目昆蟲果蠅中腸PCD是一種自噬性死亡,沒有凋亡性死亡,而鱗翅目昆蟲家蠶中腸PCD中卻是先發(fā)生自噬,然后發(fā)生凋亡,但家蠶中腸PCD自噬轉化成凋亡的機制尚不清楚。因此,不同昆蟲中腸的PCD的機制有所不同。昆蟲PCD的發(fā)生依賴于蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone,20E),在家蠶脂肪體中,20E可以通過上調自噬相關基因和凋亡相關基因的表達來促進脂肪體PCD。在家蠶絲腺中,20E可以引起胞內Ca2+水平的升高最終活化下游的Caspase-3導致PCD。鈣離子的變化和平衡對細胞行使多種功能有著重要的作用,胞質中的鈣離子水平相對較低,而胞外可以維持較高的鈣離子水平。在一些細胞中,胞內鈣離子的增加可以促進自噬。另外還有一些細胞中,胞內鈣離子的增加可以活化鈣依賴蛋白酶Calpain,Calpain一旦活化后,就會引起自噬相關蛋白5(ATG5)切割成氨基端ATG5(NtATG5),這樣自噬的過程就會受阻,凋亡就會增強。因此,我們推測20E增加的細胞內Ca2+在自噬與凋亡的轉化中發(fā)揮重要作用。為了驗證我們的假設以及解決自噬研究領域存在的科學問題,我們以鱗翅目昆蟲棉鈴蟲的中腸PCD作為模型,并以棉鈴蟲的表皮細胞系(HaEpi)作為平臺開展研究,以回答自噬的功能究竟是一種存活還是死亡,自噬與凋亡究竟是一種什么關系以及自噬轉向凋亡的分子機制等科學問題。研究結果在鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中,自噬相關基因(ATGs)和凋亡相關基因(Caspases)都在變態(tài)期高表達,而且都響應20E的誘導。大部分自噬相關基因的表達要先于凋亡相關基因。20E可以誘導微管輕鏈3蛋白-磷脂酰乙醇胺(LC3-Ⅱ,又名ATG8)的形成,表明自噬受20E的誘導,但是轉染pIEx-RFP-GFP-LC3-His熒光雙標簽質粒進一步檢測自噬發(fā)現(xiàn),20E誘導的自噬不能持續(xù)下去,這表明自噬在20E誘導的晚期呈現(xiàn)出下降趨勢,而凋亡卻顯著增加,說明20E誘導的自噬最終轉向了凋亡。在鱗翅目昆蟲棉鈴蟲中腸程序性細胞死亡過程中(PCD),既存在自噬也存在凋亡而且自噬發(fā)生在前凋亡的發(fā)生在后。LC3-Ⅱ形成的增加預示自噬的水平的增加;活化的Caspase-3和流式細胞儀用于檢測凋亡的水平。凋亡發(fā)生時Caspase-3被活化同時自噬相關蛋白ATG5被切割產生氨基端ATG5(NtATG5)。在棉鈴蟲的表皮細胞系(HaEpi)中,相對較低濃度20E情況下,LC3-Ⅱ的形成增多預示著自噬會逐漸增強,在相對較高濃度的20E情況下,ATG5被切割成為NtATG5,Caspase-3的活性逐漸增強,預示著自噬轉向了凋亡。當干擾ATG5或施加自噬的抑制劑3-甲基嘌呤(3-MA)時,20E誘導的自噬和凋亡會受到抑制。但是,當施加凋亡的抑制劑Ac-DEVD-CHO時,可以抑制20E誘導的凋亡,但沒有阻止20E誘導的自噬。這暗示了自噬控制并決定凋亡。另外,高濃度20E可以誘導胞內Ca2+水平升高促進ATG5的切割成NtATG5,Caspase-3的活化,進而將自噬轉向凋亡。阻止20E誘導的胞內Ca2+的升高將會導致NtATG5以及活化的Caspase-3下降,細胞會維持自噬存活。在人類乳腺癌細胞中,20E可誘導自噬的發(fā)生,但是當施加高濃度的Ca2+時,自噬會轉化成凋亡。這些結果表明胞內高濃度的Ca2+將細胞自噬性存活轉為凋亡性死亡,而且20E誘導了胞內高濃度的Ca2+促進了自噬向凋亡的轉化。結論1.自噬是一種存活過程,凋亡是一種細胞死亡過程。當?shù)蛲鍪艿揭种茣r,細胞將處于自噬的存活狀態(tài)。這與果蠅中腸的自噬死亡不一樣,可能是物種間調控機制的差異。2.20E誘導中腸自噬和凋亡先后發(fā)生并促使自噬向凋亡轉化。自噬是凋亡的前提,凋亡終結自噬。闡明了中腸中自噬與凋亡的關系不是簡單的拮抗關系。3.20E通過增加細胞內鈣離子濃度促進自噬向凋亡轉化。高濃度的20E誘導胞內Ca2+增加,高水平的Ca2+使ATG5被切割成NtATG5進而活化Caspase-3引起凋亡。抑制Ca2+通道可以阻止自噬向凋亡的轉化。在沒有鈣離子時自噬不能被轉化成凋亡。該結果在人乳腺癌細胞中可以得到驗證。確定了自噬轉向凋亡的關鍵因子是鈣離子。科學意義闡明了 20E調控鈣離子增加,介導自噬轉化為凋亡是中腸PCD的分子機制;自噬是一種存活過程而凋亡是一種細胞死亡過程;Ca2+離子的濃度決定了自噬向凋亡的轉化。豐富了昆蟲中腸PCD的理論,為防治病蟲害提供了新的靶標。為自噬的功能及在細胞存活與死亡中的機制提供了新的理論依據(jù)。
[Abstract]:The research background and existing scientific problems of programmed cell death (PCD) mainly include autophagy and apoptosis. Autophagy refers to the process that cells degrade some of their damaged proteins or organelles when they are subjected to pressure or nutritional deficiency to generate energy for their own survival. Apoptosis refers to the body through its own genes and their products. The active and orderly process of regulating the death of the body, known as type I PCD., has two main views on autophagy: one is autophagy that leads to cell survival. In many mammalian cells, autophagy is a survival process, such as in human fibroblasts and T cells. The other is that autophagy is a death process, both type II PC. D, such as the degradation of the midgut in the Drosophila. Therefore, whether autophagy is alive or dead, what is the relationship between autophagy and apoptosis and the molecular mechanism of autophagy to apoptosis is a scientific problem to be solved today. In the course of the transition from larva to pupae, the insect is degraded in the old midgut, including autophagy and apoptosis, including autophagy and apoptosis. Therefore, the midgut PCD in insects provides an ideal model for the study of autophagy and apoptosis and the relationship between the two. The midgut PCD of the Diptera Insect is a autophagy death and no apoptotic death. However, autophagy occurs in the midgut PCD of the Lepidoptera silkworm, and then apoptosis occurs, but the mechanism of PCD autophagy in the midgut of the Bombyx mori is not yet a mechanism of apoptosis. It is clear that the mechanism of PCD in the midgut of different insects is different. The occurrence of insect PCD is dependent on the ecdysone (20-Hydroxyecdysone, 20E). In the fat body of the silkworm, 20E can promote the fat body PCD. in the silk gland by up regulation of autophagy related genes and apoptosis related genes, and 20E can cause the increase of intracellular Ca2+ level most. The final activation of the downstream Caspase-3 leads to the change and balance of PCD. calcium ions to play an important role in the exercise of various functions. The level of calcium ions in the cytoplasm is relatively low, while the extracellular calcium levels can maintain high levels of calcium ions. In some cells, the increase of intracellular calcium can promote autophagy. In addition, some cells, intracellular calcium, are also available. The increase of ions activates calcium dependent protease Calpain, when Calpain is activated, it causes autophagy related protein 5 (ATG5) to cut into the amino terminal ATG5 (NtATG5), so the process of autophagy will be blocked and apoptosis will increase. Therefore, we speculate that the intracellular Ca2+ in 20E has an important role in the transformation of autophagy and apoptosis. On the basis of our hypothesis and the scientific problems that exist in the field of autophagy, we use the midgut PCD of the Lepidoptera cotton bollworm as a model, and take the epidermal cell line (HaEpi) of the cotton bollworm as a platform to study whether the function of autophagy is a survival or death, and what is the relationship between autophagy and apoptosis. The molecular mechanism of autophagy turned to apoptosis. In the Lepidoptera cotton bollworm, the autophagy related genes (ATGs) and apoptosis related genes (Caspases) are highly expressed in the metamorphosis stage, and all respond to the induction of 20E. Most autophagy related genes are expressed first by apoptosis related gene.20E to induce microtubule light chain 3 protein - The formation of phosphatidylethanolamine (LC3- II, also known as ATG8) showed that autophagy was induced by 20E, but the transfection of pIEx-RFP-GFP-LC3-His fluorescence double label plasmid further detected autophagy found that the autophagy induced by 20E could not continue, indicating that autophagy showed a downward trend in the late stage of 20E induction, while apoptosis was significantly increased, indicating 20E induced autophagy. Apoptosis. In the middle intestinal programmed cell death (PCD) of Lepidoptera (Lepidoptera, Helicoverpa armigera), there is both autophagy and apoptosis and the occurrence of autophagy occurring before the apoptosis of.LC3- II indicates an increase in the level of autophagy; activated Caspase-3 and flow cytometry are used to detect the level of apoptosis. When Caspase-3 was activated and autophagy associated protein ATG5 was cut to produce amino terminal ATG5 (NtATG5). In the epidermis cell line (HaEpi) of Helicoverpa armigera (HaEpi), relatively low concentration 20E, the increase of LC3- II indicates that autophagy increases gradually. In relatively high concentration of 20E, ATG5 is cut into NtATG5, Caspase-3 activity gradually Enhancement indicates autophagy to apoptosis. When 3- methyl purine (3-MA) is used to interfere with ATG5 or autophagy, the autophagy and apoptosis induced by 20E can be inhibited. However, when the apoptosis inhibitor Ac-DEVD-CHO is applied, the apoptosis induced by 20E can be inhibited, but the autophagy induced by 20E is not prevented. This implies autophagy control and determines apoptosis. In addition, high concentration of 20E can induce the increase of intracellular Ca2+ level and promote the cleavage of ATG5 into NtATG5, the activation of Caspase-3, and then the autophagy to apoptosis. To prevent 20E induced intracellular Ca2+ rise will lead to the decrease of NtATG5 and activated Caspase-3, and the cell will maintain autophagy. In human breast cancer cells, 20E can induce autophagy. However, when high concentration of Ca2+ was applied, autophagy could be transformed into apoptosis. These results suggest that high intracellular concentration of Ca2+ turns autophagic survival to apoptotic death, and 20E induces high intracellular concentration of Ca2+ to promote the transformation of autophagy to apoptosis. Conclusion 1. autophagy is a survival process and apoptosis is a cell death process. At the time of inhibition, the cell will be in the state of autophagy. This is different from the autophagy death in the midgut of the Drosophila. It may be the difference between the regulation mechanism of the species..2.20E induces autophagy and apoptosis in the midgut and promotes autophagy to apoptosis. Autophagy is the precondition of apoptosis. Apoptosis terminates autophagy. The relationship between autophagy and apoptosis is clarified. Not a simple antagonistic relationship.3.20E promotes autophagy by increasing intracellular calcium concentration to promote autophagy to apoptosis. High concentration of 20E induces intracellular Ca2+ increase, high level Ca2+ causes ATG5 to be cut into NtATG5 and activates Caspase-3 to induce apoptosis. Inhibition of Ca2+ channels can prevent autophagy from transforming into apoptosis. Autophagy can not be used in the absence of calcium ions. Transformation into apoptosis. This result can be verified in human breast cancer cells. The key factor for autophagy to apoptosis is calcium ion. Scientific significance clarifies that 20E regulates the increase of calcium ions and mediates the transformation of autophagy into apoptosis as a molecular mechanism of midgut PCD; autophagy is a survival process and a cell death process; Ca2+ ions The concentration determines the transformation of autophagy to apoptosis. It enriches the theory of PCD in the midgut of insects and provides a new target for the prevention and treatment of diseases and insect pests. It provides a new theoretical basis for the function of autophagy and the mechanism of cell survival and death.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q25

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本文編號：2003496