本文關鍵詞：產腸毒素大腸桿菌（ETEC）F4菌毛特異性蛋白受體—豬源氨肽酶N的研究　出處：《揚州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：新生和斷奶仔豬腹瀉是全球范圍內影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的最為普遍的胃腸道疾病,主要與產腸毒素大腸桿菌(ETEC) F4(或K88)在仔豬腸道內的黏附、定植和感染有關,該病原不僅能夠引發(fā)仔豬黃痢、白痢、水腫病和斷奶仔豬腹瀉等多種疾病,還易混合和繼發(fā)多種疾病感染。ETEC F4病原菌有ab、ac、ad三種血清型變異株,其中以F4ac最為常見。這三種血清型F4大腸桿菌在腸道細胞黏附力、黏附素faeG基因和致病性上具有一定的差異。研究發(fā)現,ETEC F4能否特異性結合豬小腸黏膜上皮細胞,取決于豬小腸黏膜上有無相應的受體,無F4受體的豬表現為抗性,不會感染F4大腸桿菌發(fā)��；而有受體的豬則表現為敏感,在感染F4大腸桿菌后發(fā)病。也就是說,F4ab、F4ac、F4ad大腸桿菌在宿主腸道內的黏附、定植和感染取決于F4ab、F4ac、F4ad菌毛和小腸黏膜上特異性受體之間的互作。自1975年以來,有關F4菌毛受體的相關基因和蛋白陸續(xù)被報道,但遺憾的是,選擇并鑒別真正的受體基因或候選蛋白仍然是研究的難點,而對于已經發(fā)現的受體基因和蛋白,也仍然缺乏直接有效的方法和證據來進行鑒別。近年來,豬源氨肽酶N (APN)被報道稱是一種新型的F4菌毛黏附受體,并在F4 ETEC細菌的內化和機體免疫過程中發(fā)揮了重要的作用。因此,本研究選取APN蛋白作為研究對象,通過多種方法驗證其作為ETEC F4的直接受體蛋白的可能性和可信度,并確定其功能結合域,從而獲得抗病育種的目的基因或靶標蛋白,進而探討F4+三種不同血清型變異株的感染致病機制和相關信號通路,為研發(fā)新型有效候選疫苗和培育抗病性優(yōu)勢豬種提供技術支撐,旨在從根本上減少或控制仔豬細菌性腹瀉的發(fā)生。由于黏液素4(MUC4)基因內含子7的多態(tài)性變異位點與大多數ETEC F4的黏附表型相關,本研究通過檢測MUC4基因內含子7的多態(tài)性來對不同豬種的不同個體進行初步分型,結合新鮮屠宰豬腸道的刷狀緣細胞的細菌黏附實驗結果,確定實驗樣本豬。提取豬空腸RNA后PCR獲得APN的全長基因,體外表達、純化APN蛋白,免疫小鼠并制備相應的多克隆抗體。利用Red同源重組的方法構建F4+ETEC菌毛缺失株,同時構建攜帶fae全操縱子表達的SE5000重組菌,并進行了上述缺失株、重組菌及野生菌的體外黏附實驗、黏附抑制實驗。同時,構建能夠穩(wěn)定表達的APN過表達細胞系pEC129-APN IPEC-J2和APN沉默細胞系pcDNATM6.2-GW/miR-APN IPEC-J2,將表達出的蛋白與活體分離的APN蛋白進行功能性對比,通過酶活性實驗、細胞免疫組化等確定原核表達、真核表達蛋白以及生物體內APN蛋白的酶活性及其對于宿主細胞識別病原菌能力的影響。利用酵母雙雜交、Pull-down和Western blot等方法驗證蛋白-蛋白之間的相互作用,為APN蛋白與菌毛蛋白的直接互作提供證據。同時,探討APN蛋白對F4大腸桿菌體外黏附的影響,APN蛋白與F4菌毛蛋白互作的功能性結合域,比較APN蛋白與F4三種血清型互作的差異,并初步探究鋅離子依賴型蛋白APN在鋅離子作用條件下的作用機理和相關信號通路,主要研究內容分為以下6個部分：1.豬產腸毒素大腸桿菌F4受體的初步分型有研究表明,ETEC F4的受體基因可被精細定位于豬染色體SSC13q41區(qū)域,并與MUC4基因密切相關。根據MUC4基因內含子7在限制性內切酶Xba Ⅰ作用下所表現出的多態(tài)性,可以在基因水平上將所檢測的豬分為易感型純合子SS,易感型雜合子SR和抵抗型RR。本實驗利用MUC4基因多態(tài)性的這一特性,對送檢豬的樣品進行初步的分型檢測,并結合新鮮屠宰豬腸道刷狀緣細胞的黏附表型結果篩選目的樣本,選取基因分型結果和細菌黏附實驗結果相一致的對應樣本,即代號長白202和梅山2877對應豬的樣品進行后續(xù)實驗,兩者分別為易感型純合子和易感型雜合子,且小腸刷狀緣細胞的細菌黏附實驗結果均為強黏附型。2.豬源氨肽酶N基因的克隆和表達系統(tǒng)的構建為探討APN作為產腸毒素大腸桿菌F4受體蛋白的可能性,根據GenBank上豬APNmRNA序列設計合成特異性引物,從新鮮屠宰的梅山仔豬易感個體小腸組織中提取總RNA并反轉錄成cDNA第一鏈,RT-PCR擴增豬APN全長基因,并分別構建真核表達和原核表達系統(tǒng)。重組質粒測序和酶切結果顯示：APN基因已正確插入pcDNA3.1真核表達載體和pET-28a(+)原核表達載體,SDS-PAGE結果證明重組蛋白為包涵體,且純化產物在110 KDa處有單一明顯條帶。pcDNA3.1-APN和pET28a-APN雙系統(tǒng)的成功構建以及APN蛋白的成功表達,為進一步研究和驗證該蛋白作為豬F4菌毛受體候選蛋白的可能性奠定了基礎和平臺。3. FaeG介導豬源氨肽酶N與產腸毒素大腸桿菌ETEC F4+的黏附FaeG亞單位是菌毛主要的功能性亞基,該亞單位與糖蛋白或糖脂受體識別相關,有助于病原菌附著到宿主細胞。本研究利用構建所得的大腸桿菌F4+fae全操縱子基因表達的重組菌和△faeG缺失株探討APN與大腸桿菌F4+FaeG亞基之間的相互作用。結果顯示,純化后的APN蛋白能夠和F4+ETEC之間發(fā)生肉眼可見的凝集反應,證明該蛋白能夠識別并結合三種血清型的F4+菌毛,而△faeG缺失株與APN蛋白之間的凝集反應明顯減弱。酵母雙雜交、pull-down等實驗的陽性結果也證明,FaeG亞單位蛋白與APN蛋白之間也能夠直接發(fā)生相互作用,這些結果證明FaeG是菌毛有效的直接黏附功能亞基,也是APN蛋白作用的靶點部位。4.豬氨肽酶N對產腸毒素大腸桿菌(ETEC) F4黏附力的影響有研究表明,APN能夠促進小腸上皮細胞內吞F4ac菌毛,誘導黏膜免疫的發(fā)生。前期研究中,我們發(fā)現APN蛋白與F4菌毛的主要亞單位FaeG蛋白間存在直接的相互作用。本研究中,利用篩選獲得的APN靜默穩(wěn)定表達細胞系pcDNATN6.2-GW/miR-APN IPEC-J2/Caco-2和APN過表達穩(wěn)定細胞系pEC129-APN IPEC-J2/Caco-2進行一系列的功能驗證試驗,以未處理的IPEC-J2/Caco-2細胞作為對照,探討APN對大腸桿菌F4黏附力的影響。結果表明,與對照組細胞相比,RNAi干擾細胞系的APN表達量明顯降低,pEC129-APN細胞系的APN表達量則顯著高于上述兩個細胞系；而細胞對細菌的黏附能力則與細胞中APN的表達量變化呈正相關。5.豬源氨肽酶N功能結合域的研究在前期研究中,我們發(fā)現,APN與F4菌毛的主要亞單位FaeG之間存在直接的蛋白互作,而APN表達量的高低能夠直接影響細胞對細菌的黏附。為了進一步驗證APN在F4菌毛與宿主細胞相互作用中發(fā)揮的功能,探究其作用機理,本實驗利用重疊多肽陣列技術高通量篩查APN與F4ab、F4ac、F4ad菌毛FaeG亞單位的互作位點,并結合Pull-down、 Western blot等試驗進行驗證,最終確定APN的功能結合域。比較APN蛋白與F4三種血清型FaeG蛋白的結合位點,可知APN-FaeG的結合位點主要集中于F4ab FaeG蛋白的148-160、199-217位氨基酸(aa)殘基；F4ac FaeG蛋白的149-161、176-188、200-218位氨基酸(aa)殘基；F4ad FaeG蛋白的149-161、200-218位氨基酸(aa)殘基。6.豬源氨肽酶N作用機理的探究鋅離子(Zn2+)是豬生長發(fā)育過程中重要的微量金屬離子,Zn2+的缺乏常常會導致仔豬生長發(fā)育不良,而適量的高鋅飼料不僅有利于仔豬的健康生長,還能明顯減少仔豬下痢。APN是一種鋅離子依賴型的膜結合外肽酶,具有鋅離子結合激活位點。前期研究表明,高濃度的Zn2+溶液能夠降低APN蛋白的生物學活性。為了探討APN蛋白與Zn2+之間的相關性,以及它們在F4大腸桿菌黏附、定植、誘發(fā)疾病過程中的作用機理,本實驗針對與APN基因轉錄和體內Zn2+濃度變化都密切相關的蛋白激酶MAPK信號通路,以及相關的細胞因子展開了探索研究。研究發(fā)現,在一定的濃度范圍內,Zn2+能夠減少F4大腸桿菌對細胞的黏附,還能夠對細胞內ERK、p38、JNK蛋白的磷酸化以及相關細胞因子的表達產生影響。
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.61

【參考文獻】

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1 蔣雋,施啟順,柳小春,黃生強,賀長青;不同豬種腸毒素大腸桿菌(ETEC)F4受體微衛(wèi)星標記遺傳差異性研究[J];遺傳;2004年02期

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本文編號：1316081