發(fā)布時間：2017-10-16 06:16

  本文關鍵詞：紅尾沙蜥適應低氧環(huán)境的生理和生化機制研究

  更多相關文章： 沙蜥屬 青藏高原 紅尾沙蜥 低氧適應 低氧誘導因子 血管內皮生長因子 肌紅蛋白 一氧化氮合酶 一氧化氮

【摘要】：紅尾沙蜥(Phrynocephalus erythrurus)是世界上垂直分布最高的爬行動物,棲息于青藏高原北部海拔4500-5300m之間。青藏高原平均海拔4000m以上,是全世界最高的高原,低氧和寒冷是其主要的環(huán)境特征。在這樣嚴酷的環(huán)境下,經過長期的自然選擇,世居高原的動物表現出了一系列對高原環(huán)境獨特的適應特征。本學位論文選用紅尾沙蜥及低海拔分布的同屬荒漠沙蜥(Phrynocephalus przewalskii)為研究對象,采用生理生化和分子生物學的方法從種間比較分析了兩種沙蜥的心肺結構、心肌和骨骼肌毛細血管密度、肌紅蛋白濃度、一氧化氮合酶活性和一氧化氮(NO)含量等方面的差異以及與低氧調控相關的基因如低氧誘導因子(HIFs)、血管內皮生長因子(VEGF-A)、肌紅蛋白(Mb)、氧化氮合酶(NOSs)的表達情況來探究紅尾沙蜥對高海拔低氧環(huán)境的適應特征。主要研究結果如下：與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥肺部毛細血管分支節(jié)點更多,毛細血管網孔更小,呈現規(guī)律性“正多邊形”排列；同時,紅尾沙蜥肺內部還具有更多獨特的蜂窩狀氣室結構,這種構筑形式有效增大了毛細血管與肺泡的接觸面積。由此可見,紅尾沙蜥具有更復雜的肺部結構和更大的肺內表面積,這可能是紅尾沙蜥提高氣體交換效率的一種策略。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥心肌和骨骼肌毛細血管分布更為豐富。組織毛細血管的增加是紅尾沙蜥對低氧環(huán)境的適應特征之一,有利于血液和組織細胞的氧氣轉運。低氧誘導因子HIF-1α和HIF-2α在機體低氧適應過程中處于核心的調控地位,其下游靶基因VEGF-A的表達能夠促進毛細血管的發(fā)生與形成。研究表明,低氧可以誘導上述基因的表達。但是在本實驗中我們發(fā)現,與低海拔荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥肺中HIF-1α和HIF-2α mRNA表達顯著降低,分別下降了50.3%和65.1%(P0.001)；心肌和骨骼肌中兩種基因的表達無種間差異。紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中VEGF-A mRNA的表達也明顯低于荒漠沙蜥,肺中VEGF-AmRNA的表達兩種沙蜥間無明顯差異。這些結果表明紅尾沙蜥中上述基因的表達不僅存在明顯的組織特異性而且還具有獨特的低氧響應鈍化特征。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥肺、心肌和骨骼肌毛細血管密度增加,但其調控基因VEGF-AmRNA表達水平并未上調,這可能是因為VEGF-A在紅尾沙蜥中存在轉錄后調控。相關性分析發(fā)現,紅尾沙蜥和荒漠沙蜥不同組織中HIF-1α、HIF-2αc和VEGF-A mRNA表達量之間并無一致的正相關性,這可能與上述基因均存在多重調控有關。另外,兩種沙蜥HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A編碼區(qū)序列均出現氨基酸位點替換,這是否與高海拔環(huán)境適應有關還有待于進一步研究。Mb是重要的氧貯存和運輸蛋白,低氧條件下在細胞供氧過程中發(fā)揮著重要的作用。本論文通過RACE-PCR克隆了紅尾沙蜥和荒漠沙蜥Mb基因序列全長,比對發(fā)現了3個氨基酸位點替換,分別為Thr13Ile、Lys87Thr 和 His118Asn。通過同源建模分析兩種沙蜥肌紅蛋白三維空間結構發(fā)現,紅尾沙蜥肌紅蛋白heme pocket體積比荒漠沙蜥更大,這意味著更小的空間位阻,有利于氧氣的結合和卸載。同時,紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中Mb mRNA的表達均明顯高于荒漠沙蜥,分別是其表達量的2.4倍和3.1倍。紅尾沙蜥骨骼肌Mb濃度也明顯高于荒漠沙蜥,但心肌中無顯著差異。另外,我們還發(fā)現兩種沙蜥心肌中Mb mRNA表達量和蛋白濃度均約為骨骼肌中的2倍。上述結果與大多數動物中Mb低氧適應機制的研究結論一致。這些結果說明紅尾沙蜥也采取了這一適應策略,利用較高的肌紅蛋白來提高組織的供氧效率。NO是調節(jié)血管張力和結構最重要的內源性舒張因子,主要來源于L-Arg催化反應。該反應的唯一關鍵酶是一氧化氮合酶(NOS),主要有eNOS、nNOS和iNOS三種亞型。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥心肌、肺和骨骼肌中eNOS mRNA的表達水平沒有顯著差異。紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中nNOS mRNA表達水平顯著高于荒漠沙蜥,分別增加了248.9%和119.2%。肺中nNOS mRNA表達兩種沙蜥沒有差異。紅尾沙蜥心肌iNOS mRNA表達顯著高于荒漠沙蜥,約為其4.1倍。肺和骨骼肌中iNOS mRNA表達兩種沙蜥無顯著差異。與荒漠沙蜥相比,紅尾沙蜥骨骼肌中總NOS酶活性明顯下降而其他組織中沒有差異。紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中iNOS酶活性顯著低于荒漠沙蜥,分別下降了66.9%和46.7%。血清和肺中iNOS酶活性未表現出種間差異。紅尾沙蜥血清、肺、心肌和骨骼肌中NO含量均顯著低于荒漠沙蜥。這些結果表明紅尾沙蜥心肌和骨骼肌中nNOS和iNOS mRNA的表達是選擇性上調的,但其心肌和骨骼肌中iNOS酶活性卻受到了抑制。我們推測這些特征可能與紅尾沙蜥長期高海拔棲息地低氧環(huán)境有關,也是其重要的適應特征之一綜上所述,作者認為紅尾沙蜥在心肺結構和脈管系統及與低氧調控相關的基因表達等方面均表現出了一系列獨特的生理和生化適應特征及分子調控機制,這些研究進一步豐富和完善了高原低氧適應機制研究的理論體系,有助于更好的保護高原生物多樣性,同時也為高原醫(yī)學研究和發(fā)展提供了參考。
【關鍵詞】：沙蜥屬 青藏高原 紅尾沙蜥 低氧適應 低氧誘導因子 血管內皮生長因子 肌紅蛋白 一氧化氮合酶 一氧化氮
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q494
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-14
• 第一章 陸棲脊椎動物高原適應研究概況14-23
• 1.1 呼吸系統對低氧的適應15-16
• 1.1.1 肺通氣響應15-16
• 1.1.2 肺結構的改變16
• 1.2 心臟對低氧的適應16
• 1.3 氧運輸系統16-17
• 1.4 代謝強度和酶活性對低氧的適應17-18
• 1.5 低氧響應基因的表達變化及調控18-23
• 1.5.1 低氧誘導因子19-20
• 1.5.2 血管內皮生長因子20-22
• 1.5.3 促紅細胞生成素22
• 1.5.4 一氧化氮合酶22-23
• 第二章 青藏高原沙蜥屬蜥蜴研究概況23-26
• 2.1 中國沙蜥屬研究概述23-24
• 2.2 青藏高原沙蜥屬蜥蜴研究24-26
• 第三章 紅尾沙蜥心肺、脈管系統對高海拔低氧的生理適應26-39
• 3.1 引言26
• 3.2 材料26-29
• 3.2.1 樣本采集26-27
• 3.2.2 主要試劑及配制27-29
• 3.3 實驗方法29-31
• 3.3.1 肺組織顯微結構29
• 3.3.2 心肌和骨骼肌毛細血管密度29-30
• 3.3.3 數據分析30-31
• 3.4 實驗結果31-37
• 3.4.1 心肺重量和心肺重量與體重比31-32
• 3.4.2 肺組織顯微結構觀察32-34
• 3.4.3 心肌毛細血管密度34
• 3.4.4 骨骼肌毛細血管密度34-37
• 3.5 討論37-39
• 第四章 紅尾沙蜥HIFs和VEGF-A基因克隆及mRNA表達研究39-71
• 4.1 引言39
• 4.2 樣品采集39-40
• 4.3 主要實驗儀器及試劑40-42
• 4.3.1 主要實驗儀器40
• 4.3.2 主要試劑40-41
• 4.3.3 主要溶液配制41-42
• 4.3.4 主要分析軟件和在線分析程序42
• 4.4 實驗方法42-52
• 4.4.1 紅尾沙蜥和荒漠沙蜥組織總RNA提取42-43
• 4.4.2 去除總RNA中的基因組DNA43
• 4.4.3 RT-PCR cDNA第一鏈合成43-44
• 4.4.4 RACE-PCR cDNA合成44
• 4.4.5 紅尾沙蜥HIF-1和VEGF-A基因序列擴增44-50
• 4.4.6 Real-time PCR50-52
• 4.5 結果52-67
• 4.5.1 不同組織總RNA提取52-53
• 4.5.2 HIF-1α和HIF-2α RT-PCR擴增53
• 4.5.3 HIF-1α和HIF-2α RACE-PCR擴增53-54
• 4.5.4 HIF-1α和HIF-2α cDNA序列生物信息學分析54-62
• 4.5.5 VEGF-A基因RT-PCR擴增62
• 4.5.6 VEGF-A cDNA序列生物信息學分析62-65
• 4.5.7 Real-time PCR內參基因的選擇65
• 4.5.8 不同組織HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A mRNA表達65-67
• 4.5.9 HIF-1α、HIF-2α和VEGF-A mRNA表達相關性分析67
• 4.6 討論67-71
• 第五章 紅尾沙蜥肌紅蛋白對高原低氧的適應71-87
• 5.1 引言71
• 5.2 樣品采集71
• 5.3 主要實驗儀器和試劑71
• 5.4 實驗方法71-73
• 5.4.1 肌紅蛋白RT-PCR及RACE-PCR71-72
• 5.4.2 肌紅蛋白序列分析72-73
• 5.4.3 肌紅蛋白三維空間結構及同源建模評估73
• 5.4.4 肌紅蛋白mRNA的表達73
• 5.4.5 肌紅蛋白濃度的測定73
• 5.5 結果73-83
• 5.5.1 肌紅蛋白RT-PCR和RACE-PCR73-74
• 5.5.2 肌紅蛋白cDNA全長序列分析74-76
• 5.5.3 肌紅蛋白氨基酸序列分析76-79
• 5.5.4 肌紅蛋白三維空間結構與同源建模評估79-82
• 5.5.5 肌紅蛋白mRNA表達82
• 5.5.6 肌紅蛋白濃度82-83
• 5.6 討論83-87
• 第六章 紅尾沙蜥一氧化氮含量及一氧化氮合酶對高原低氧的適應87-104
• 6.1 引言87
• 6.2 樣品采集87
• 6.3 主要實驗儀器和試劑87
• 6.4 方法87-94
• 6.4.1 RNA提取及cDNA反轉錄87-88
• 6.4.2 eNOS、nNOS和iNOS基因的克隆88-89
• 6.4.3 eNOS,nNOS和iNOS Real-time PCR89-90
• 6.4.4 NOS酶活測定90-92
• 6.4.5 NO含量測定92-93
• 6.4.6 組織蛋白濃度的測定93-94
• 6.4.7 數據分析94
• 6.5 結果94-100
• 6.5.1 NOSs基因RT-PCR及序列分析94-96
• 6.5.2 兩種沙蜥不同組織中eNOS、nNOS和iNOS mRNA表達水平96-98
• 6.5.3 iNOS和總NOS酶活性測定98-99
• 6.5.4 NO含量99-100
• 6.6 討論100-104
• 6.6.1 長期的高原低氧適應增加了紅尾沙蜥nNOS和iNOS mRNA的表達100-101
• 6.6.2 較低水平的iNOS酶活性是紅尾沙蜥適應高原低氧環(huán)境的策略之一101-102
• 6.6.3 紅尾沙蜥NO含量與長期的高原低氧適應間的關系102-104
• 第七章 結論與創(chuàng)新104-106
• 7.1 主要結論104-105
• 7.2 創(chuàng)新點105-106
• 參考文獻106-119
• 在讀期間發(fā)表論文情況119-120
• 學術交流與獲獎情況120-121
• 學術交流120
• 獲獎情況120-121
• 參與科研項目121-122
• 致謝122-124
• 附錄124-151

【參考文獻】

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本文編號：1041074