【摘要】：肽的抗氧化活性被得到廣泛認可,且具有營養(yǎng)價值高及吸收快等優(yōu)點。因此,抗氧化肽在開發(fā)延緩衰老的保健食品中具有極大的應用前景。然而,目前對于食源性抗氧化肽的研究仍處于實驗室階段,對于抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系及定向制備等方面的研究還不夠深入和系統(tǒng),因而較難進行產(chǎn)業(yè)化推廣。本論文對氨基酸及二肽的體外抗氧化活性進行了系統(tǒng)的研究,探討了影響二肽體外抗氧化活性的關(guān)鍵性因素,并研究了抗氧化二肽的定量構(gòu)效關(guān)系,旨在為后續(xù)抗氧化肽蛋白原料的定向篩選及目標抗氧化肽的高效制備提供理論指導。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)探討了DPPH及ABTS法評價氨基酸及肽類物質(zhì)抗氧化活性時存在的問題并對其進行適當?shù)母倪M。結(jié)果表明,在DPPH法中,堿性氨基酸Arg會使DPPH?還原后的產(chǎn)物DPPHH發(fā)生去質(zhì)子化反應,導致在檢測波長515-525 nm處有很強的吸收強度,從而對該方法的檢測產(chǎn)生干擾;采用醋酸鹽緩沖溶液,并控制這個反應體系的最終pH值維持在弱酸環(huán)境中,可以避免上述干擾。在ABTS法中,不同的氨基酸及二肽清除ABTS?+的能力受pH影響不同,其中Tyr、Trp及其相關(guān)的二肽清除ABTS?+的反應速率隨著pH值的升高而加快,而Cys及其相關(guān)的二肽則受pH影響較小;在pH 7.4下,所有檢測的氨基酸及二肽清除ABTS?+在常用的6-10 min的反應時間內(nèi)均不能達到反應終點,至少需要反應30 min才能基本達到平衡。(2)研究了20種氨基酸及40種二肽在ABTS、ORAC、DPPH、還原力及Fe2+離子螯合能力等方法中的抗氧化活性,探討了抗氧化氨基酸對二肽體外抗氧化活性的影響,并進一步通過測定9種多肽的抗氧化活性進行驗證。結(jié)果表明,在ABTS及ORAC法中,Tyr、Trp及含有Tyr/Trp殘基的二肽均具有非常強的自由基清除活性(Trolox當量為0.74-5.90μmol TE/μmol),其次為Cys、Met及含有Cys/Met殘基的二肽(Trolox當量為0.14-2.00μmol TE/μmol),而其余不含Tyr、Trp、Cys或Met的二肽則基本無活性;在DPPH及還原力法中,只有Cys及含Cys殘基的二肽具有明顯的抗氧化活性(Trolox當量為0.12-0.85μmol TE/μmol);在Fe2+螯合能力方面,這些氨基酸及二肽均沒有檢測到活性。這說明了Tyr、Trp、Cys及Met等4種抗氧化氨基酸是決定二肽抗氧化活性的關(guān)鍵性因素。經(jīng)測定9種多肽的體外抗氧化活性也驗證了這個規(guī)律。(3)研究了不同類型的二肽在AAPH誘導的血紅細胞氧化損傷模型中溶血的保護作用,探討了抗氧化氨基酸對二肽在血紅細胞氧化損傷模型中保護作用的影響,并進一步以Tyr-Gly、Trp-Gly、Cys-Gly及Met-Gly為研究對象,探討了其保護作用機制。結(jié)果表明所有含Tyr、Trp、Cys及Met殘基的二肽對AAPH誘導的血紅細胞溶血均具有一定的保護作用,其中含Trp殘基的二肽保護作用最強,而其余不含這四種抗氧化氨基酸殘基的二肽則基本無保護作用。此外,Tyr-Gly、Trp-Gly、Cys-Gly及Met-Gly等二肽在該模型中對血紅細胞溶血的保護作用均具有時間及濃度依賴關(guān)系,并能降低血紅細胞中血紅蛋白的氧化程度以及延緩血紅細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的消耗。這些二肽主要是通過清除ROO?,阻斷自由基鏈式反應,從而達到保護作用。(4)進一步研究了48種N端或C端含有Tyr/Trp殘基二肽的體外抗氧化活性,并通過氨基酸描述符及密度泛函理論對其進行定量構(gòu)效關(guān)系研究。結(jié)果表明,大部分二肽其序列中Tyr/Trp殘基在N端比其在C端具有更強的ABTS?+及ROO?清除能力,且其鄰位氨基酸殘基對二肽的抗氧化活性也有一定的影響;DPPS模型表明含Tyr殘基的二肽其序列中C端氨基酸殘基的空間立體大小、疏水性、氫鍵形成能力及電性與其ABTS?+清除能力呈負相關(guān),而其N端氨基酸殘基的疏水性及氫鍵形成能力與其活性呈正相關(guān);密度泛函理論研究表明二肽序列中Tyr及Trp殘基側(cè)鏈基團的前線分子軌道的電子云分布情況及其BDE、IP、PA和ETE值基本不受其鄰位氨基酸殘基的影響,可能是受場效應、空間效應及氫鍵作用等因素的影響。(5)基于抗氧化肽的氨基酸組成特點,定向的篩選了適合于制備抗氧化肽的蛋白原料,并通過Sephadex G-25及UPLC-ESI-UHR-TOF-MS/MS技術(shù)對目標抗氧化肽進行分離鑒定。結(jié)果表明,大米蛋白、酪蛋白、花生分離蛋白、大豆分離蛋白、小麥面筋蛋白及明膠等蛋白原料的酶解產(chǎn)物在ABTS及ORAC法中的抗氧化活性與其蛋白原料中的Tyr、Trp、Cys及Met等抗氧化氨基酸的含量高度相關(guān)(尤其是Tyr及Trp),其中富含Tyr和Trp的大米蛋白及酪蛋白的酶解產(chǎn)物抗氧化活性最強,而缺乏Tyr、Trp、Cys及Met等抗氧化氨基酸的明膠其酶解產(chǎn)物抗氧化活性最弱。以大米蛋白為原料對其進行酶解及分離鑒定,最后在大米蛋白復合蛋白酶(Protease M)水解產(chǎn)物中共鑒定出27條含有Tyr或Trp等抗氧化氨基酸殘基的肽段,并通過合成驗證發(fā)現(xiàn)這些肽段均具有較強的抗氧化活性,其中YR、WN、YY、AW、WV、YW、IW、YNPR、TYNPR、GYPR、NWR、WQSS、WQS、IGYPR、LGYPR、LQPY、TNPW、MYPIPR、MYPLPR及VNPW等20條肽段的抗氧化活性強于標準抗氧化劑Trolox。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TS201.2

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本文編號：2752356