【摘要】：β-胡蘿卜素是一種抗氧化、防癌且具有免疫功能的類胡蘿卜素,廣泛應用于食品添加劑、營養(yǎng)增補劑、化妝品等行業(yè)。本文采用代謝工程的手段,結(jié)合生物元件的構(gòu)建、外源基因表達和代謝途徑調(diào)控等技術,在耶羅維解脂酵母中構(gòu)建了β-胡蘿卜素生物合成途徑,優(yōu)化了異戊二烯途徑中的關鍵基因,并對構(gòu)建蝦青素合成途徑的可行性進行了初步研究。首先,從三孢布拉霉或卷枝毛霉中克隆了β-胡蘿卜素合成基因,并將其整合到耶羅維解脂酵母的基因組內(nèi),構(gòu)建了合成β-胡蘿卜素的重組菌株。整合三孢布拉霉carRA和carB基因的工程菌(YH202)和整合卷枝毛霉carRP和carB(M)基因的工程菌(YM202)的β-胡蘿卜素產(chǎn)量分別為4.35 mg/L和3.90 mg/L,結(jié)果表明在耶羅維解脂酵母中表達三孢布拉霉β-胡蘿卜素合成基因更有利于β-胡蘿卜素的生物合成。要提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量,增加前體物質(zhì)的供應十分必要。HMG-CoA還原酶可以催化HMG-CoA生成甲羥戊酸,是甲羥戊酸途徑重要的限速步驟。本文對耶羅維解脂酵母的HMG-CoA還原酶基因的催化區(qū)域(HMGcata)進行了研究,發(fā)現(xiàn)過表達HMGcata將HMG-CoA還原酶的酶活提高了65%,β-胡蘿卜素從4.35mg/L提高至6.95 mg/L。在麥角固醇途徑中,ERG9基因編碼的角鯊烯合酶催化法尼�；沽姿�(FPP)合成角鯊烯,是影響FPP流向的關鍵酶。我們嘗試用釀酒酵母中可調(diào)控的MET3啟動子(硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶硫激酶啟動子,ATP硫激酶啟動子)或CTR3啟動子(銅離子調(diào)節(jié)型啟動子)替換ERG9的Qg源啟動子來弱化ERG9基因的表達,但結(jié)果不理想,表明源于釀酒酵母的MET3或CTR3啟動子在耶羅維解脂酵母中并不起作用。在耶羅維解脂酵母中,大部分類胡蘿卜素存儲于脂質(zhì)體中,增加脂質(zhì)體的產(chǎn)生有助于提高β-胡蘿卜素的積累。因此本實驗中研究脂質(zhì)體合成和降解途徑的調(diào)節(jié)對β-胡蘿卜素產(chǎn)量的影響。在耶羅維解脂酵母模式菌株H222中分別構(gòu)建了導入一個拷貝β-胡蘿卜素合成基因的菌株H306、敲除GUT2基因(編碼3-磷酸甘油脫氫酶異構(gòu)酶)的菌株H405、敲除POX1-6基因(編碼�；o酶A氧化酶)的菌株H512、及敲除GUT2及POX1-6的菌株H611。通過分析其生長狀態(tài)和β-胡蘿卜素產(chǎn)量發(fā)現(xiàn),敲除GUT2導致菌株生物量降低9.1%,β-胡蘿卜素產(chǎn)量提升4.6倍;敲除POX1-6導致生物量降低15.0%,β-胡蘿卜素產(chǎn)量提升5.4倍;GUT2和POX1-6均敲除導致生物量降低30.2%,β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提升11.5倍。結(jié)果表明增加脂質(zhì)體的產(chǎn)生能促進β-胡蘿卜素的積累,但也會影響菌株的生長。URA3/5-FOA篩選系統(tǒng)能夠重復地將多個基因整合到耶羅維解脂酵母基因組的不同部位�；谠撓到y(tǒng),逐步往耶羅維解脂酵母ATCC20362菌株導入三個β-胡蘿卜素合成基因和兩個HMGcata基因,并且敲除GUT2與POX2基因,構(gòu)建了產(chǎn)β-胡蘿卜素的工程菌株YC607。隨著基因的不斷整合,改造菌株的β-胡蘿卜素產(chǎn)量逐步增加。YC607菌株搖瓶發(fā)酵時最終能夠積累72.89 mg/L的β-胡蘿卜素,比整合單拷貝β-胡蘿卜素合成基因的YH202菌株(4.35 mg/L)增長了16.7倍。接下來探討不同濃度的葡萄糖與甘油對β-胡蘿卜素合成的影響,發(fā)現(xiàn)采用4%甘油作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源時,β-胡蘿卜素的產(chǎn)量達到96.88 mg/L。采用分批補料發(fā)酵的方式在5-L發(fā)酵罐中對改造菌株YC607進行高密度培養(yǎng)。分批補加葡萄糖時,生物量和β-胡蘿卜素產(chǎn)量最高分別為97.6 g/L和443.02 mg/L。后用甘油替換葡萄糖分批補加,生物量最高時達到130.0 g/L,β-胡蘿卜素的產(chǎn)量也達到613.63 mg/L。通過在β-胡蘿卜素的工程菌株YC607中導入海洋細菌Agrobacterium aurantiacum的crtZ基因(編碼β-胡蘿卜素羥化酶)和crt W基因(編碼β-胡蘿卜素酮化酶),發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素幾乎全部被轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生了28.48 mg/L角黃素、3.64mg/L玉米黃質(zhì)和1.42 mg/L蝦青素。蝦青素中間產(chǎn)物角黃素的大量積累表明A.aurantiacum的crtZ基因在耶羅維解脂酵母表達能力較弱。本研究首次在耶羅維解脂酵母中實現(xiàn)了角黃素、玉米黃質(zhì)和蝦青素的生物合成。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海醫(yī)藥工業(yè)研究院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TQ929

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 朱秀靈,車振明,徐偉,焦云鵬,熊華;β-胡蘿卜素的生理功能及其提取技術的研究進展[J];廣州食品工業(yè)科技;2004年02期

2 常峰;王忠彥;胡承;羅t，

本文編號：2320427