本文關(guān)鍵詞：利用可溶性誘導(dǎo)物批式流加發(fā)酵培養(yǎng)里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶　出處：《大連理工大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 木質(zhì)纖維素類生物質(zhì) 纖維素酶 里氏木霉 誘導(dǎo)物 β-葡萄糖苷酶 分 批補(bǔ)料策略

【摘要】：基于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)資源生產(chǎn)的生物燃料和生物基化學(xué)品具有可再生和環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn),對(duì)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。這類生物質(zhì)的生物煉制主要包括預(yù)處理、纖維素酶生產(chǎn)、纖維素組分酶解糖化和微生物發(fā)酵等單元操作及這些操作單元的系統(tǒng)集成和優(yōu)化,而纖維素酶成本高是制約生物煉制產(chǎn)業(yè)化技術(shù)開(kāi)發(fā)的瓶頸之一。里氏木霉(Trichoderma reesei)是纖維素酶高產(chǎn)菌株,但該菌株纖維素酶合成需要誘導(dǎo)。纖維素是T.reesei纖維素酶合成的天然誘導(dǎo)物,以微晶纖維素最有效,盡管其價(jià)格昂貴。然而,纖維素是不溶性的,需要依靠菌株低水平本底纖維素酶緩慢水解釋放出真正誘導(dǎo)物才能誘導(dǎo)纖維素酶大量合成,這一過(guò)程顯著延長(zhǎng)了纖維素酶發(fā)酵時(shí)間,相應(yīng)降低了發(fā)酵罐纖維素酶生產(chǎn)強(qiáng)度。由于T.reesei液體深層發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶為高粘度非牛頓型流體且強(qiáng)好氧過(guò)程,生產(chǎn)強(qiáng)度低導(dǎo)致纖維素酶發(fā)酵過(guò)程攪拌和通風(fēng)的能耗成本極高。使用預(yù)處理后的秸稈、蔗渣及紙漿等廉價(jià)纖維質(zhì)原料作為誘導(dǎo)物,雖然可以解決微晶纖維素等成本高的問(wèn)題,但菌株本底纖維素酶水解這類纖維質(zhì)原料的效率極低,導(dǎo)致誘導(dǎo)產(chǎn)纖維素酶效果非常差,纖維素酶發(fā)酵生產(chǎn)的能耗成本更高�？扇苄哉T導(dǎo)物可以被菌株直接利用,預(yù)期可以有效解決纖維素類誘導(dǎo)物存在的突出問(wèn)題,然而目前開(kāi)發(fā)的乳糖等可溶誘導(dǎo)物不僅成本較高,而且纖維素酶誘導(dǎo)效果差。本研究合成了低成本高效可溶誘導(dǎo)物,在此基礎(chǔ)上以T.reeseiRut C30為模式菌株,對(duì)纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)、纖維素酶系改造優(yōu)化以及原位生產(chǎn)的粗酶水解預(yù)處理后秸稈等過(guò)程進(jìn)行了研究。以葡萄糖為底物,利用β-葡萄糖苷酶催化的轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng),制備含(β)二糖的可溶誘導(dǎo)物。轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)特點(diǎn)使反應(yīng)結(jié)束時(shí)殘留大量葡萄糖,這種葡萄糖和(β)二糖混合物(MGD),可以更好促進(jìn)菌絲生長(zhǎng),同時(shí)高效誘導(dǎo)纖維素酶合成。此外,還選擇并研究了 β-1,3-葡聚糖對(duì)T.reesei生長(zhǎng)和纖維素酶合成的誘導(dǎo)效果。搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MGD和β-1,3-葡聚糖更容易被菌體利用,誘導(dǎo)纖維素酶合成能力分別是乳糖的1.16倍和1.24倍,纖維素酶關(guān)鍵組分基因表達(dá)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果。雖然MGD和β-1,3-葡聚糖誘導(dǎo)里氏木酶產(chǎn)纖維素酶效果相近,但是MGD成本較低。利用離子色譜分析了MGD的組成,發(fā)現(xiàn)二糖類誘導(dǎo)物主要為龍膽二糖、纖維二糖和槐糖,其中槐糖起最主要誘導(dǎo)作用。比較了酸水解甜菊糖苷制備槐糖和β-葡萄糖苷酶催化轉(zhuǎn)化葡萄糖制備MGD,與酸水解甜菊糖苷相比,β-葡萄糖苷酶催化轉(zhuǎn)化葡萄糖制備MGD在成本以及過(guò)程重復(fù)性上都有優(yōu)勢(shì),而且無(wú)論是使用商業(yè)β-葡萄糖苷酶還是自制β-葡萄糖苷酶,其催化轉(zhuǎn)化高濃度葡萄糖生成的MGD,均能高效誘導(dǎo)里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶。以MGD為誘導(dǎo)物,在7 L發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層培養(yǎng)T.reesT.Rut C30生產(chǎn)纖維素酶。為避免MGD中高濃度葡萄糖對(duì)里氏木霉合成纖維素酶的抑制,開(kāi)發(fā)了基于控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度流加MGD進(jìn)行補(bǔ)料的策略,葡萄糖濃度控制為0.05-0.30 g/L。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,發(fā)酵時(shí)間144 h時(shí),纖維素酶活達(dá)到90.4 FPU/mL,比報(bào)道的乳糖誘導(dǎo)纖維素酶酶活水平高10倍以上,纖維素酶生產(chǎn)強(qiáng)度高達(dá)627.1 FPU/L/h,是目前報(bào)道T.reesei生產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)強(qiáng)度的3-5倍。為了評(píng)價(jià)MGD誘導(dǎo)的纖維素酶(Cel-MGD),測(cè)定兩種纖維素酶的比酶活并利用分泌蛋白組學(xué)分析對(duì)比了 Cel-MGD與堿預(yù)處理后玉米秸稈(APCS)作為誘導(dǎo)物生產(chǎn)纖維素酶(Cel-APCS)的蛋白組成,結(jié)果表明Cel-MGD誘導(dǎo)的纖維素酶和β-葡萄糖苷酶比酶活分別提高1.74倍和2.42倍,但Cel-MGD中仍嚴(yán)重缺乏β-葡萄糖苷酶,而Cel-APCS含有更高的木聚糖酶活和纖維素降解輔助蛋白。為了彌補(bǔ)Cel-MGD中嚴(yán)重缺乏β-葡萄糖苷酶的缺陷,構(gòu)建了組成型強(qiáng)啟動(dòng)子Ppdcl高效過(guò)表達(dá)外源β-葡萄糖苷酶基因aabgll的表達(dá)載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將其導(dǎo)入T..reeseiRutC30,轉(zhuǎn)化子生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力普遍提高。利用產(chǎn)葡萄糖苷酶最高的重組菌T.reesei PB3分批補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶,156 h纖維酶活超過(guò)50 FPU/mL,β-葡萄糖苷酶酶活超過(guò)310 CBU/mL,比宿主菌β-葡萄糖苷酶酶活提高約70倍。該重組酶命名為Cel-MGD2,其與補(bǔ)加商品β-葡萄糖苷酶的Cel-MGD水解15%(w/v)APCS性能無(wú)顯著差別,葡萄糖收率均超過(guò)92%,發(fā)酵過(guò)程乙醇濃度超過(guò)44.0 g/L。提高APCS的濃度到20%(w/v),利用Cel-MGD2進(jìn)行分步糖化發(fā)酵(SHF)和同步糖化發(fā)酵(SSF)生產(chǎn)乙醇,在SHF工藝條件下發(fā)酵120h,終點(diǎn)乙醇濃度達(dá)到54.2 g/L,而SSF條件下發(fā)酵96h,終點(diǎn)乙醇濃度為52.1g/L。雖然SSF過(guò)程產(chǎn)乙醇濃度略低,但乙醇生產(chǎn)強(qiáng)度顯著提高。這些結(jié)果表明改造后的重組酶不需要復(fù)配就可以用于預(yù)處理后秸稈類生物質(zhì)水解。為實(shí)現(xiàn)纖維素和半纖維素的綜合利用,在T.reesei Rut C30過(guò)表達(dá)同源外切纖維素酶基因cbh2構(gòu)建纖維素酶高產(chǎn)菌株,并以MGD和APCS混合誘導(dǎo)物提高纖維素酶中木聚糖酶活性,生產(chǎn)可高效水解含有高濃度半纖維素原料的纖維素降解酶。優(yōu)化MGD和APCS比例后,通過(guò)分批補(bǔ)料,發(fā)酵60h時(shí)纖維素酶活達(dá)到7.17FPU/mL,木聚糖酶活性達(dá)到577.55 IU/mL,該粗酶液比MGD或APCS單獨(dú)誘導(dǎo)的纖維素酶降解APCS的效果更好,而且粗酶液不需要進(jìn)行任何處理即直接進(jìn)行預(yù)處理后的秸稈水解,粗酶液提高溫度至50℃,批次加入APCS至20%,最終測(cè)定釋放122.5 g/L葡萄糖和40.21 g/L木糖,產(chǎn)糖效果高于已有報(bào)道。研究工作進(jìn)展對(duì)高效生產(chǎn)纖維素酶,特別是原位產(chǎn)酶應(yīng)用于木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)生物煉制,具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TQ925

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 乞永立,耿月霞,任章啟;纖維素酶的生產(chǎn)及應(yīng)用[J];河北化工;2000年01期

2 楊葉東,韓yN君,張金龍;纖維素酶的研究、生產(chǎn)及其在紡織上的應(yīng)用[J];激光生物學(xué)報(bào);2000年02期

3 汪測(cè)生;纖維素酶[J];山東紡織科技;2000年04期

4 汪多仁;纖維素酶在紡織工業(yè)中的應(yīng)用[J];四川化工與腐蝕控制;2000年05期

5 孟雷,陳冠軍,王怡,高培基;纖維素酶的多型性[J];纖維素科學(xué)與技術(shù);2002年02期

6 張威;新一代的纖維素酶[J];國(guó)外紡織技術(shù);2004年06期

7 劉桂榮,張?chǎng)?鄭明珠;纖維素酶的生產(chǎn)及應(yīng)用前景[J];食品研究與開(kāi)發(fā);2004年01期

8 韓韞,蔡俊鵬;產(chǎn)纖維素酶海洋菌株的篩選及鑒定[J];現(xiàn)代食品科技;2005年03期

9 王菁莎,王頡,劉景彬;纖維素酶的應(yīng)用現(xiàn)狀[J];中國(guó)食品添加劑;2005年05期

10 趙榮樂(lè);;纖維素酶研究進(jìn)展[J];喀什師范學(xué)院學(xué)報(bào);2005年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 呂東海;周巖民;李如治;;飼用纖維素酶及其應(yīng)用研究進(jìn)展[A];酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[C];2005年

2 陳清華;馮欽龍;周輝;;纖維素酶生產(chǎn)的研究進(jìn)展[A];酶制劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用[C];2005年

3 楊家華;郭志宏;;纖維素酶在反芻動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用[A];中國(guó)奶牛協(xié)會(huì)2007年會(huì)論文集（上冊(cè)）[C];2007年

4 曾濤;曾會(huì)才;陳漢清;;海南省部分纖維素酶高產(chǎn)菌株的分離與鑒定[A];2009年海南省微生物學(xué)檢測(cè)及質(zhì)量保證研討會(huì)論文集[C];2009年

5 王鳳超;陳冠軍;劉巍峰;;環(huán)境基因組文庫(kù)的構(gòu)建及纖維素酶基因的篩選[A];2008年中國(guó)微生物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2008年

6 王娟;李欣;吳松剛;黃建忠;;長(zhǎng)梗木霉外切纖維素酶基因的克隆及其表達(dá)[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要匯編[C];2009年

7 王驥;丁明;李燕紅;陳清西;許根俊;趙輔昆;;動(dòng)物內(nèi)源性纖維素酶:福壽螺(Ampullaria crossean)多功能纖維素酶基因的克隆[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2003年學(xué)術(shù)交流會(huì)論文摘要集[C];2003年

8 馮文英;;固體纖維素酶的浸漬條件優(yōu)化及其特性研究[A];中國(guó)造紙學(xué)報(bào)2003年增刊——中國(guó)造紙學(xué)會(huì)第十一屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2003年

9 趙輔昆;王驥;陳清西;許根俊;;纖維素酶的研究進(jìn)展[A];第七屆全國(guó)酶學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2004年

10 姚強(qiáng);黃琰;陳冠軍;;產(chǎn)耐堿性纖維素酶絲狀真菌的篩選及研究[A];山東微生物學(xué)會(huì)第六次會(huì)員代表大會(huì)暨2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（上）[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 平遠(yuǎn) 譯;纖維素酶可提高秸稈飼料利用率[N];福建科技報(bào);2004年

2 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 孫洪新邋甄二英;纖維素酶在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用[N];中國(guó)畜牧獸醫(yī)報(bào);2008年

3 王菁莎　王頡 劉景彬;纖維素酶的應(yīng)用現(xiàn)狀[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2009年

4 劉國(guó)信;開(kāi)發(fā)纖維素酶制劑大有可為[N];經(jīng)理日?qǐng)?bào);2004年

5 陸慕寒 整理;35項(xiàng)印染行業(yè)節(jié)能減排先進(jìn)技術(shù)——助劑篇(二)[N];中國(guó)紡織報(bào);2008年

6 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 王紀(jì)亭;飼料原料資源匱乏出路何在[N];中國(guó)畜牧報(bào);2003年

7 ;2009年印染行業(yè)節(jié)能減排優(yōu)秀技術(shù)創(chuàng)新成果推介[N];中國(guó)紡織報(bào);2009年

8 馮衛(wèi)東;科技將這樣改變我們的生活[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

9 ;高活力纖維素酶生產(chǎn)技術(shù)　[N];中國(guó)化工報(bào);2002年

10 本報(bào)記者 李曉巖;生物煉制：突破纖維素利用瓶頸[N];中國(guó)化工報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張慶;瑞氏木霉纖維素酶降解模式及其功能多樣性研究[D];山東大學(xué);2015年

2 張聰;Cytophaga hutchinsoni纖維素酶系研究[D];山東大學(xué);2015年

3 韓超;嗜熱真菌新的熱穩(wěn)定纖維素酶的克隆、表達(dá)和功能研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 呂新星;里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子X(jué)yr1功能研究及銅離子響應(yīng)高效表達(dá)體系的建立[D];山東大學(xué);2015年

5 郭紅;高固體系纖維素酶水解與回收強(qiáng)化研究[D];天津大學(xué);2015年

6 劉奎美;纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及纖維素酶應(yīng)用的研究[D];山東大學(xué);2016年

7 韓小龍;纖維素酶補(bǔ)料發(fā)酵工藝及木糖渣生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究[D];山東大學(xué);2017年

8 王美美;耐堿性纖維素酶的表達(dá)及其對(duì)紙漿改性和機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2017年

9 李勇昊;利用可溶性誘導(dǎo)物批式流加發(fā)酵培養(yǎng)里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶[D];大連理工大學(xué);2017年

10 張飛;利用人工鋅指蛋白技術(shù)提高里氏木霉Rut-C30纖維素酶產(chǎn)量[D];大連理工大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 耿月姍;纖維素酶在幾種咪唑類離子液體中活性研究[D];天津大學(xué);2009年

2 錢(qián)文佳;南極細(xì)菌產(chǎn)低溫纖維素酶的研究[D];哈爾濱工業(yè)大學(xué);2009年

3 舒勤;嗜堿性芽孢桿菌Bacillus sp.AC-2產(chǎn)纖維素酶的研究[D];浙江大學(xué);2004年

4 趙燕;高效纖維素酶高產(chǎn)菌的篩選及相關(guān)研究[D];武漢科技大學(xué);2013年

5 李娜;耐熱真菌纖維素酶基因的克隆與序列分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

6 田海嬌;纖維素酶生產(chǎn)菌的篩選、誘變及產(chǎn)酶機(jī)制的初步研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

7 訾曉雪;不同底物誘導(dǎo)下樺剝管菌纖維素酶活和蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

8 譚玲;高效水解甘油有機(jī)溶劑預(yù)處理麥草纖維素酶制劑的選擇和復(fù)配[D];江南大學(xué);2015年

9 李靖一;pGAP調(diào)控下的內(nèi)切纖維素酶組成型表達(dá)及酶制劑的制備[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

10 王帥;纖維素酶活性架構(gòu)及TrCel12A關(guān)鍵亞位點(diǎn)氨基酸功能研究[D];山東大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1350477