腦心肌炎病毒(Encephalomy ocarditis virus,EM CV)屬小R N A病毒科心病毒屬的成員,其宿主譜廣泛,可引起人畜急性心肌炎、腦炎、糖尿病、生殖障礙等癥狀,給國內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生造成巨大的經(jīng)濟損失和危害。近年來針對EMCV的研究愈來愈多,但該病毒的感染機制及致病機理仍不明確。本研究主要基于課題組前期酵母雙雜交及病毒覆蓋蛋白結(jié)合等實驗篩選出的能夠與病毒蛋白互作的熱休克蛋白90β(Heat shock protein 90β,HSP90β)進行深入的探究,以期明確HSP90β在腦心肌炎病毒體外感染中的調(diào)控作用及其機制。通過上調(diào)或下調(diào)細胞中HSP90β的表達后接種EMCV,檢測病毒拷貝數(shù)及病毒滴度,明確HSP90β對EMCV體外增殖的影響。利用qPCR及WB等實驗進一步探索HSP90β對EMCV調(diào)控作用的具體機制,研究結(jié)果如下:1、上調(diào)宿主細胞中HSP90β的表達顯著促進EMCV的體外增殖,反之,利用siRNA下調(diào)HSP90β的表達顯著抑制EMCV的體外增殖,而且HSP90β的抑制劑GA也顯著抑制EMCV的體外增殖。2、EMCV結(jié)構(gòu)蛋白VP2與HSP90β共定位且...

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖2-1 HSP90β基因的PCR擴增及重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

以HEK293細胞的cDNA為模板,進行PCR擴增,所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,在2175bp處可見特異性條帶,與預(yù)期大小相符(圖2-1-A)。將構(gòu)建的pCMV-Myc-HSP90β重組質(zhì)粒用SalI和NotI限制性內(nèi)切酶進行雙酶切,酶切后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,在2....

圖2-2上調(diào)HSP90β對EMCV體外增殖的影響

在HEK293細胞上轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-HSP90β重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染36h后進行接毒。收取細胞分別檢測HSP90β基因及蛋白的表達情況。結(jié)果如下圖所示,轉(zhuǎn)染組HSP90β的mRNA及蛋白表達與對照組相比均顯著升高(圖2-2-A/B)。qPCR檢測病毒拷貝數(shù),如圖2-2-C圖所示,....

圖2-3敲低HSP90β對EMCV增殖的影響

上調(diào)HSP90β可以顯著促進EMCV的體外增殖,為探究清楚下調(diào)HSP90β會對EMCV的體外增殖有何影響,因此又使用針對HSP90β的特異性siRNA進行瞬時敲低實驗。合成的3條siRNA中siHSP90β-1干擾效果最佳,因此選擇它進行后續(xù)的干擾實驗(圖2-3-A)。瞬時敲低....

圖2-4抑制劑GA對EMCV增殖的影響

Geldanamycin是常用的一種針對HSP90的特異性抑制劑,通常簡稱為GA,它主要是通過與HSP90結(jié)構(gòu)中的NTD結(jié)構(gòu)域中的ATP/ADP結(jié)合域結(jié)合,進而干擾它穩(wěn)定客戶蛋白的能力,即抑制了HSP90的活性。首先檢測不同濃度的GA是否對細胞存在毒性作用,發(fā)現(xiàn)四個濃度的GA對于....

本文編號：4048583