慢生單胞菌為分離自海洋沉積物中的捕食性細(xì)菌類群,其分離工作的難度較高,因此對(duì)于該類群檢測(cè)方法的研究,對(duì)確定其在環(huán)境中的分布情況以及與其他類群相關(guān)關(guān)系分析有著重要意義。本研究針對(duì)慢生單胞菌目設(shè)計(jì)出了特異性的寡核苷酸探針,并通過純培養(yǎng)菌株實(shí)驗(yàn)對(duì)其嚴(yán)謹(jǐn)性及覆蓋度進(jìn)行了驗(yàn)證。根據(jù)探針序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)熒光定量PCR引物。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)所設(shè)計(jì)出的寡核苷酸探針可以與目前已培養(yǎng)的所有慢生單胞菌物種進(jìn)行雜交,同時(shí)與本實(shí)驗(yàn)所選擇的非目標(biāo)類群雜交結(jié)果為陰性。進(jìn)而選取了文登鹽場(chǎng)5個(gè)不同鹽度梯度的鹽池以及運(yùn)城鹽湖6個(gè)鹽池的沉積物樣品作為研究對(duì)象,使用16S rRNA基因序列擴(kuò)增子測(cè)序、qPCR以及熒光原位雜交三種方法對(duì)樣品中的慢生單胞菌目豐度進(jìn)行分析。通過16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序檢測(cè),在所有鹽湖及鹽場(chǎng)的沉積物樣品中都檢測(cè)到了慢生單胞菌目的存在,共注釋出屬于慢生單胞菌目的91個(gè)OTU,其中文登鹽場(chǎng)沉積物中獨(dú)有的OTU有49個(gè),運(yùn)城鹽湖沉積物中獨(dú)有的OTU有15個(gè),慢生單胞菌目在文登鹽場(chǎng)平均相對(duì)豐度為0.81%,在運(yùn)城鹽湖所有沉積物樣品中的平均相對(duì)豐度為0.16%。通過qPCR對(duì)樣品中細(xì)菌16S rDNA序列... 

【文章頁數(shù)】：152 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞
第一章 緒論
    1.1 高鹽環(huán)境及其中的微生物
        1.1.1 高鹽環(huán)境及其分類
        1.1.2 高鹽環(huán)境中的微生物
        1.1.3 國(guó)內(nèi)外對(duì)高鹽環(huán)境微生物的研究
    1.2 環(huán)境中的微生物群落及其網(wǎng)絡(luò)分析
    1.3 慢生單胞菌目及其研究進(jìn)展
    1.4 環(huán)境微生物的檢測(cè)方法
        1.4.1 培養(yǎng)方法檢測(cè)環(huán)境中的微生物
        1.4.2 熒光原位雜交技術(shù)
        1.4.3 高通量測(cè)序技術(shù)
        1.4.4 定量PCR (Quantitative-PCR)
    1.5 立題依據(jù)
第二章 慢生單胞菌目水平探針及引物的設(shè)計(jì)
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品與菌株
        2.1.2 主要儀器與設(shè)備
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        2.1.4 溶液與培養(yǎng)基配置
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 慢生單胞菌目特異性探針的設(shè)計(jì)及合成
        2.2.2 以探針序列為引物進(jìn)行高通量測(cè)序驗(yàn)證探針的可靠性
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)所用菌株的培養(yǎng)以及菌體收集
        2.2.4 純培養(yǎng)菌株熒光原位雜交
        2.2.5 探針熒光原位雜交最適條件的優(yōu)化
        2.2.6 驗(yàn)證探針嚴(yán)謹(jǐn)性和覆蓋度的實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 慢生單胞菌目qPCR引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 所設(shè)計(jì)探針及其覆蓋度
        2.3.2 以探針序列為引物進(jìn)行高通量測(cè)序結(jié)果
        2.3.3 熒光原位雜交最適條件探究
        2.3.4 所設(shè)計(jì)探針嚴(yán)謹(jǐn)性和覆蓋度的純菌實(shí)驗(yàn)
        2.3.5 慢生單胞菌目qPCR引物的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證
    2.4 本章小結(jié)
第三章 文登鹽場(chǎng)及運(yùn)城鹽湖沉積物中慢生單胞菌目豐度檢測(cè)
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.2 主要儀器與設(shè)備
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        3.1.4 溶液及培養(yǎng)基配置
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 沉積物樣品的固定及樣品DNA提取
        3.2.2 沉積物樣品PCR擴(kuò)增、16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序及分析
        3.2.3 熒光定量PCR分析
        3.2.4 沉積物樣品FISH試驗(yàn)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序慢生單胞菌目的豐度
        3.3.2 熒光定量PCR結(jié)果
        3.3.3 FISH檢驗(yàn)結(jié)果
        3.3.4 慢生單胞菌豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)性分析
    3.4 本章小結(jié)與討論
第四章 文登鹽場(chǎng)和運(yùn)城鹽湖細(xì)菌群落多樣性分析
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 采樣地點(diǎn)及樣品信息
        4.1.2 主要儀器與設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 樣品處理
        4.2.2 理化因子的測(cè)定
        4.2.3 16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序及數(shù)據(jù)處理
        4.2.4 分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論
        4.3.1 樣品的理化因子特征
        4.3.2 不同樣品中的物種組成及α-多樣性分析
        4.3.3 樣品之間共有OTU分析
        4.3.4 理化因子對(duì)樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響
        4.3.5 水樣及沉積物樣品的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析
    4.4 本章小結(jié)
第五章 兩株海洋新菌的多相分類研究
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)所用菌株
        5.1.2 主要儀器與設(shè)備
        5.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材
        5.1.4 溶液及培養(yǎng)基的配置
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 16S rRNA基因序列分析
        5.2.2 基因組序列分析
        5.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析
        5.2.4 菌株表型和生理生化分析
        5.2.5 細(xì)菌化學(xué)組分測(cè)定
        5.2.6 菌種保藏
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
        5.3.1 檸檬色淤泥桿菌(Lutibacter citreus)1KV19~T的多相分類
        5.3.2 海濱革蘭氏菌(Gramella litoralis)KN1008~T的多相分類
    5.4 本章小結(jié)
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望與不足
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄
    附錄一 實(shí)驗(yàn)所用主要儀器與設(shè)備
    附錄二 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑與耗材
    附錄三 實(shí)驗(yàn)所用主要溶液及培養(yǎng)基的配置
    附錄四 部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
資助情況
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)位論文
學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表



本文編號(hào)：3654657