神經(jīng)元是人類(lèi)大腦中的基本單元,它們互相連接,組成了復(fù)制而精密的神經(jīng)環(huán)路。探究這些環(huán)路對(duì)于了解大腦的運(yùn)作原理具有重大的意義。腺相關(guān)病毒（AAV）是標(biāo)記神經(jīng)環(huán)路的常用工具,也是基因治療的重要載體之一。現(xiàn)有的具有逆向示蹤能力的AAV工具種類(lèi)較少,能夠標(biāo)記的神經(jīng)環(huán)路也較少,并且標(biāo)記效率還有待提高。這些不足限制了AAV病毒載體在神經(jīng)環(huán)路逆向標(biāo)記中的應(yīng)用。本文主要通過(guò)定向突變和隨機(jī)突變的方式,改造不同AAV病毒血清型的基因組,提高AAV載體在不同環(huán)路中的逆向示蹤效率。改造涉及了AAV1型、2型和DJ型病毒。通過(guò)定點(diǎn)突變改造后的AAVDJR病毒載體獲得了較強(qiáng)的逆向示蹤紋狀體到皮層、丘腦和杏仁核的能力。通過(guò)定向突變改造后的AAV2R-9M病毒在紋狀體通路比原始的rAAV2-retro具有更高效的逆向示蹤能力,并且本文還對(duì)比了AAV2R-9M病毒在黑質(zhì)和杏仁核腦區(qū)注射的標(biāo)記效果。本文還通過(guò)隨機(jī)突變的方法建立了AAVDJR病毒Cap蛋白基因的突變文庫(kù),并運(yùn)用體內(nèi)進(jìn)化的方式篩選出了在紋狀體-黑質(zhì)通路可能具有更強(qiáng)逆向標(biāo)記效果的候選突變體。本論文改造了不同AAV病毒血清型的基因組,獲得了多種突變體,并進(jìn)行了測(cè)試... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院)廣東省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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在AAV血清型1型的Cap基因中引入AAV2-retro的三組對(duì)應(yīng)突變

第2章AAV1型和AAVDJ型病毒的定向突變改造7圖2.2在AAV血清型DJ型的Cap基因中引入AAV2-retro的三組對(duì)應(yīng)突變?nèi)鐖D2.2所示，與AAV2型N382D的氨基酸突變對(duì)應(yīng)的AAVDJ型突變位點(diǎn)為N384D突變，即在AAVDJ型的Cap蛋白第384位點(diǎn)將天冬酰胺（N）突變成了天冬氨酸（D）；對(duì)應(yīng)AAV2型V708I突變?yōu)锳AVDJ型T710I突變，即為在AAVDJ的Cap蛋白第710位點(diǎn)將蘇氨酸（T）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖）；對(duì)應(yīng)AAV2型588位點(diǎn)的插入為AAVDJ型的590位點(diǎn)插入，即在AAVDJ的Cap蛋白第590位點(diǎn)插入LADQDYTKTA十肽。因?yàn)锳AV2型的氨基酸序列和AAVDJ型的序列差異，我們的設(shè)計(jì)中進(jìn)行了一些調(diào)整，使AAVDJ的T710I突變位點(diǎn)旁邊的氨基酸序列環(huán)境與AAV2一致，因此710位點(diǎn)的蘇氨酸（T）和旁邊的絲氨酸（S）一同突變?yōu)榕cAAV2-retro對(duì)應(yīng)位點(diǎn)一致的氨基酸序列異亮氨酸（I）和天冬酰胺（N），即為圖2.2中的綠色標(biāo)記部分的序列。在AAVDJ病毒的Cap蛋白基因引入三組突變后的突變體命名為AAVDJR。之后再通過(guò)微量注射分別將病毒注射到小鼠特定腦區(qū)核團(tuán)，對(duì)病毒標(biāo)記相應(yīng)環(huán)路的效率進(jìn)行測(cè)試，再對(duì)比分析。2.2實(shí)驗(yàn)材料與步驟2.2.1實(shí)驗(yàn)試劑和耗材2.2.1.1實(shí)驗(yàn)常用藥品本文主要使用的試劑及購(gòu)買(mǎi)廠商信息詳見(jiàn)下表2.1。

AAV神經(jīng)環(huán)路示蹤病毒的改造和應(yīng)用303、將小鼠腦組織放置在模具中，加入OTC沒(méi)過(guò)小鼠腦組織。4、取一些無(wú)水乙醇，加入干冰，制造出冷凍環(huán)境。5、把模具放入冷凍的無(wú)水乙醇中進(jìn)行速凍，使小鼠腦組織固定在OTC中。6、利用切片機(jī)對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行切片，厚度為50μm/片。7、將切好的腦片收集到裝有凍存液的12孔板中，4℃保存2.2.5.3熒光成像1、將目標(biāo)腦片用PBS清洗3次，每次15min，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。2、用DAPI溶液染色15min，搖床轉(zhuǎn)速為80r/min。染色后用PBS清洗腦片3次，每次15min，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。3、將腦片貼于載玻片上，用封片劑封片。4、利用玻片掃描對(duì)腦片分別進(jìn)行不同熒光通道的成像，并導(dǎo)出圖片。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1AAV1R和AAVDJR的Cap基因突變載體的構(gòu)建和測(cè)序結(jié)果2.3.1.1AAV1R圖2.3在AAV血清型1型的Cap基因中引入AAV2-retro的三組對(duì)應(yīng)突變

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Trans-synaptic Neural Circuit-Tracing with Neurotropic Viruses[J]. Jiamin Li,Taian Liu,Yun Dong,Kunio Kondoh,Zhonghua Lu.  Neuroscience Bulletin. 2019(05)



本文編號(hào)：2962290