微生物天然產(chǎn)物結構類型復雜,生物活性多樣,是臨床、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)藥物的重要來源,如抗生素、抗癌藥物、免疫抑制劑和抗蟲藥等。在過去的幾十年中,放線菌一直是微生物天然產(chǎn)物的主要來源。隨著基因測序技術的發(fā)展,研究者從一直被忽視的伯克氏菌中挖掘到越來越多的活性天然產(chǎn)物�；凇癛ed/ET重組工程”的多種微生物重組酶系統(tǒng)和基因簇異源表達平臺的建立,為微生物天然產(chǎn)物的挖掘提供了有力的技術支撐。本研究聚焦于唐菖蒲伯克氏菌（Burkholderia gladioli）ATCC 10248中非核糖體肽類天然產(chǎn)物的挖掘,首先建立ATCC 10248的遺傳操作體系,利用該體系對6個未知的NRPS基因簇進行原位激活和失活,成功激活兩個基因簇,得到多個新型脂肽類化合物;并利用Red/ET重組工程成功克隆NRPS基因簇BGC7。主要研究結果如下:建立B.gladioliATCC 10248的遺傳操作體系。首先測定常用抗生素對ATCC 10248的最低抑制濃度,結果表明,卡那霉素、安普霉素和慶大霉素可用于菌株遺傳操作過程中的抗性篩選。然后對來源于大腸桿菌（Escherichia coli）噬菌體、銅綠假單胞菌（Pse... 

【文章來源】：山東大學山東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?Ｒｅｄ／ＥＴ重組工程的工作原理［３，６】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－１?Ｔｈｅ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ?ｏｆ?Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ??

Ｐ重組，發(fā)生在完全的單鏈ＤＮＡ和雙??鏈ＤＮＡ之間。Ｒｅｄ／ＥＴ重組酶系統(tǒng)還包含Ｒｅｄｙ蛋白與ＲｅｃＡ蛋白。Ｒｅｄｙ蛋白是??核酸酶ＲｅｃＢＣＤ的抑制蛋白［７］，?ＲｅｃＡ蛋白是依賴ＡＴＰ的ＤＮＡ重組酶［８］，這兩??種蛋白可以進一步提高重組效率。??Ｆｕ等人發(fā)現(xiàn)，Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ介導線性ＤＮＡ分子和環(huán)狀ＤＮＡ分子之間發(fā)生同??源重組的效率要高于ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ，而ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ介導兩個線性ＤＮＡ分子之間的??同源重組效率要高于Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ。由此衍生出兩種同源重組類型（圖１－２），即??Ｒｅｄａ／Ｒｅｄｐ?介導的線環(huán)重組（Ｌｉｎｅａｒ－ｃｉｒｃｕｌａｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ＬＣＨＲ）??和?ＲｅｃＥ／ＲｅｃＴ?介導的線線重組（Ｌｉｎｅａｒ－ｌｉｎｅａｒ?ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，?ＬＬＨＲ）??［９］??ｏ??ｃｍ??／?ｍｍｍｍｍ——＾??ｐｌ５Ａ－ｃｍ?（２?ｋｂ）?＾??＾??０５么?＾?ｐ�。担粒悖�?（２?ｋｂ）??十?十??ｋａｎ?＾?＿?ｋａｔｉ??ＰＣＲ?（２?ｋｂ）?ＰＣＲ（２ｋｂ）??Ｐ】５Ａ?ｃｔｎ?ｐｌ５Ａ?ａｎ??廠■■■■■■￣■■■■■■＞??ｐ?１５Ａ－ｃｍ－ｋａｎ?（４?ｋｂ）?ｐ?１５Ａ－ｃｍ－ｋａｎ?（４?ｋｂ）?｜??，??ｋａｎ??Ｊ?ｍｎｍａ，＼ｗｍ????ＬＣＨＲ?ＬＬＨＲ??圖１－２?Ｒｅｄ／ＥＴ介導的ＬＣＨＲ和ＬＬＨＲ示意圖［９】??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?ＬＣＨＲ?ａｎｄ?ＬＬＨＲ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ｂｙ?Ｒｅｄ／ＥＴ??Ｒｅｄ／ＥＴ重組系統(tǒng)發(fā)生同源重組只需要

２．１?Ｒｅｄ／ＥＴ重組工程在其他細菌中的應用??目前，Ｒｅｄ／ＥＴ重組工程己經(jīng)成功應用于痢疾桿菌［１２］、鼠??傷寒沙門氏菌（＊Ｓ＾／？ｈｏ；叱／／ａ?［１３］、根癌農(nóng)桿菌（ＪｇｒｏＡａｃｆｅｒｆｗ／Ｈ??＿等與五．ｃ〇／ｆ親緣關系較近的革蘭氏陰性菌，可以對染色體ＤＮＡ或質(zhì)粒ＤＮＡ??進行快速修飾。??對于Ｒｅｄ／ＥＴ重組工程使用受限的見ｃｏ／／遠緣菌株而言，可以依據(jù)Ｒｅｄ／ＥＴ??重組酶系統(tǒng)的建立方法，在其他細菌基因組或噬菌體上尋找類似的重組蛋白對，??建立相應的重組酶系統(tǒng)（圖１－３）。Ｙｉｎ等人在銅綠假單胞菌（Ｐｓｅｗｔ／ｏｍｏｍｗ??難菌體Ａｂ３１中發(fā)現(xiàn)了一對重組酶，由此構建了?ＧＢＡＳ重組系統(tǒng)［１５］，??可以在部分假單胞菌和伯克氏菌中介導同源重組。ｇ表示來源于五．ｃｏ／／噻菌體入??的Ｒｅｄｙ蛋白，ＢＡＳ表示來源于Ｐ?ａｅｒｗｇ＇／ｎａｓ＇ｆｌ嗤菌體Ａｂ３１的蛋白，其中Ｂ與??Ｒｅｄｐ蛋白同源，具有ＤＮＡ單鏈結合蛋白活性，Ａ與Ｒｅｄａ蛋白同源，具有５＇－３＇??核酸外切酶活性，Ｓ為另一種單鏈結合蛋白，與五．ｃｏ／／中的單鏈結合蛋白同源。??Ｃｈｅｎ等人利用ＧＢＡＳ重組系統(tǒng)，在５．?ＨＫＩ?４５４中挖掘到多個活性天??然產(chǎn)物［１６］。２０１８年，Ｗａｎｇ等人從７０２９?（現(xiàn)重新分類為??ｔｖｄ?；？?Ｊｖｄ?Ｐ?ｒｅｄ?ａ?＞ｖｄ?；？?ｔｖｅｉ?￥?＞ｖｄ?ａ??Ｅ．?ｃｏ／ｉ?ｒｅｄｙＰａ??丨?：ｌ?＂?Ｅ．?ｃｏｌｉ?ｒｅｄｙｐａ?—ｉ＾ＣＺＺ＾ＸｎｉＪ）???伯克氏菌一?＾＾為―＝１＾＾＜一??構建表達質(zhì)粒?構建表達質(zhì)粒??ｔｖｄ／?＞ｖｄａ?７０２９??Ｒｅｄｙ－Ｒｅｄａｐ７

【參考文獻】：
期刊論文
[1]革蘭氏陰性菌中β-內(nèi)酰胺酶誘導表達調(diào)控機制研究進展[J]. 徐超奕,張婷,蔡靜曉,余志良,裘娟萍,音建華.  生物工程學報. 2018(08)
[2]Red/ET同源重組技術及其在微生物基因組挖掘中的應用進展[J]. 鄭文韜,張友明,卞小瑩.  微生物學報. 2017(11)
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[4]非核糖體肽合成酶結構研究進展[J]. 李紅玲.  臨床合理用藥雜志. 2013(28)
[5]非核糖體肽合成酶的末端硫酯酶與多肽環(huán)化[J]. 方劍,朱鵬,嚴小軍.  中國生物化學與分子生物學報. 2013(07)
[6]非核糖體肽合成酶主要結構域的研究進展[J]. 鄭宗明,顧曉波,俞海青,梁鳳來,劉如林.  中國抗生素雜志. 2005(02)
[7]Red重組系統(tǒng)在痢疾桿菌基因敲除中的應用研究[J]. 胡堃,史兆興,王恒樑,馮爾玲,黃留玉.  微生物學報. 2003(06)



本文編號：2896998