MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物基因組內(nèi)數(shù)量龐大、功能多樣化的轉(zhuǎn)錄因子家族之一,廣泛地參與植物體的苯丙烷類物質(zhì)代謝調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)建成調(diào)控、細(xì)胞周期循環(huán)調(diào)控以及對(duì)逆境脅迫做出應(yīng)答等生理活動(dòng),在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抵御逆境的過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。苯丙烷代謝是植物體一條非常重要的次生代謝途徑,所有包含苯丙烷骨架的化合物都是通過(guò)這條代謝途徑生成的。苯丙烷類物質(zhì)代謝出現(xiàn)在維管植物發(fā)生分離之前,單子葉植物與雙子葉植物之間某些苯丙烷類衍生物的代謝具有進(jìn)化上的保守性。苯丙烷類衍生物在植物抵御微生物入侵、環(huán)境脅迫等過(guò)程中發(fā)揮重要作用；木質(zhì)素作為保護(hù)植物細(xì)胞壁的天然屏障,賦予細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度和硬度的同時(shí)為植物提供疏水的維管系統(tǒng),參與植物抵御真菌性病害脅迫的過(guò)程、增強(qiáng)植物抗倒伏及抗旱能力；花青素可清除植物體內(nèi)因逆境脅迫而積累的活性氧及自由基,保護(hù)植物免受因逆境脅迫而造成的氧化性損傷；原花青素積累在種子的種皮中,能加固種皮、誘導(dǎo)種子進(jìn)行冬眠、防御病原菌脅迫,保護(hù)種子不受物理及生物傷害；黃酮醇能夠吸收紫外光,發(fā)揮“紫外光過(guò)濾器”的作用,防止植物體及光合作用器官受到紫外光的輻射等。玉米是我國(guó)第一大作物,深入研究玉米苯丙烷代謝途徑對(duì)于通過(guò)分子手段選育高抗、優(yōu)質(zhì)玉米品種具有重要意義,但是玉米中苯丙烷代謝途徑的研究遠(yuǎn)滯后于雙子葉植物。擬南芥等雙子葉植物中的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與類黃酮、木質(zhì)素等苯丙烷類衍生物的調(diào)控,為玉米中苯丙烷代謝調(diào)控的研究提供重要信息。同時(shí)本課題組前期對(duì)玉米基因組中158個(gè)R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的分布規(guī)律及進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行了研究,并通過(guò)同源性分析、共表達(dá)分析、線性分析等方法篩選到苯丙烷代謝途徑中高度保守的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子基因,可能參與苯丙烷類衍生物代謝的調(diào)控。本研究以玉米優(yōu)良自交系B73為材料,從中克隆到兩個(gè)R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子ZmMYB111和ZmMYB148,并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究；研究結(jié)果表明,ZmMYB111和ZmMYB148可能通過(guò)激活苯丙烷代謝途徑限速酶PAL的活性來(lái)調(diào)控玉米中苯丙烷類衍生物的合成,但是具體影響到哪一種苯丙烷類衍生物還需進(jìn)一步研究。本研究具體結(jié)果如下：1、克隆ZmMYB111和ZmMYB148基因,得到了完整的開(kāi)放閱讀框。對(duì)ZmMYB111和ZmMYB148蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148具有典型的R2R3MYB蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域。將ZmMYB111和ZmMYB148與擬南芥等植物中調(diào)控苯丙烷代謝的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建親緣進(jìn)化樹(shù)(NJ樹(shù))并對(duì)其保守基序進(jìn)行分析,結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148與其他調(diào)控苯丙烷代謝的R2R3MYB有較近的親緣關(guān)系并含有保守的基序。2、實(shí)時(shí)定量PCR分析ZmMYB111和ZmMYB148在不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明ZmMYB111在苗期葉片、莖稈的髓部、雌花中幾乎不表達(dá),在成熟期葉、苗期根、雄花中表達(dá)量較低,在成熟期根、胚乳、成熟種子中表達(dá)量中等,莖桿上部表達(dá)量較高,莖稈下部表達(dá)量最高；ZmMYB148在苗期葉片、莖稈的髓部、雌花中幾乎不表達(dá),在成熟期葉、雄花中表達(dá)量較低,在苗期根、莖桿上部、成熟種子中表達(dá)量中等,在成熟期根、莖稈下部表達(dá)量較高,玉米胚乳中表達(dá)量最高。3、利用酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析ZmMYB111和ZmMYB148是否具有轉(zhuǎn)錄激活活性。結(jié)果顯示PGBDKT7-111和PGBDKT7-148可以在SD/-Trp/-His/3-AT/X-a-gal的缺陷型培養(yǎng)基上生長(zhǎng),說(shuō)明ZmMYB111和ZmMYB148都具有轉(zhuǎn)錄激活活性。4、基因槍轟擊洋蔥表皮細(xì)胞對(duì)ZmMYB111和ZmMYB148蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明ZmMYB148定位在細(xì)胞核中,可能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)；ZmMYB111主要定位在細(xì)胞核中,但是細(xì)胞膜上也有少量熒光,說(shuō)明ZmMYB111可能除了在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)之外,也許還參與細(xì)胞膜的保護(hù)或者膜蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程。5、克隆苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4-香豆酸COA連接酶(4CL)的啟動(dòng)子pPAL、p4CL,利用酵母單雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證克隆的轉(zhuǎn)錄因子與pPAL、p4CL在玉米體外是否可以結(jié)合。結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148可以與pPAL、p4CL結(jié)合,而且ZmMYB148與pPAL、p4CL結(jié)合能力比ZmMYB111與pPAL、 p4CL結(jié)合能力強(qiáng)。6、PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶,為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZmMYB111和ZmMYB148與pPAL的結(jié)合及對(duì)pPAL活性的影響(激活或抑制),利用基因槍轟擊玉米胚乳細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明ZmMYB111和ZmMYB148在玉米胚乳中可以與pPAL結(jié)合,增加pPAL的活性；并且ZmMYB148對(duì)pPAL的激活作用比ZmMYB111強(qiáng),該結(jié)果與酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
【學(xué)位單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q943.2
【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮寫(xiě)表
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展
        1.1.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的特征及分類
        1.1.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能及調(diào)控機(jī)制
    1.2 苯丙烷類物質(zhì)代謝的研究進(jìn)展
        1.2.1 苯丙烷類物質(zhì)代謝的起源
        1.2.2 苯丙烷類衍生物在植物體內(nèi)的合成途徑
        1.2.3 苯丙烷類衍生物在植物體內(nèi)的重要作用
    1.3 MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)苯丙烷類物質(zhì)代謝的調(diào)控
        1.3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木質(zhì)素代謝的調(diào)控
        1.3.2 MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)類黃酮代謝的調(diào)控
    1.4 本研究的意義及主要內(nèi)容
        1.4.1 本研究的意義
        1.4.2 本研究的主要內(nèi)容
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株及載體
        2.1.3 酶及試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 生物信息學(xué)軟件
        2.2.2 ZmMYB111和ZmMYB148基因的克隆
        2.2.3 ZmMYB111和ZmMYB148的組織特異性表達(dá)分析
        2.2.4 ZmMYB111和ZmMYB148轉(zhuǎn)錄激活活性分析
        2.2.5 ZmMYB111和ZmMYB148的亞細(xì)胞定位
        2.2.6 苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子的克隆
        2.2.7 酵母單雜交實(shí)驗(yàn)
        2.2.8 瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 MYB轉(zhuǎn)錄因子的克隆及生物信息學(xué)分析
        3.1.1 ZmMYB111和ZmMYB148的克隆
        3.1.2 ZmMYB111和ZmMYB148的序列及蛋白結(jié)構(gòu)分析
        3.1.3 Zm MYB111和ZmMYB148的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及保守基序分析
    3.2 ZmMYB111和ZmMYB148的組織特異性表達(dá)分析
        3.2.1 RNA提取結(jié)果
        3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.2.3 ZmMYB111和ZmMYB148在不同組織中表達(dá)情況
    3.3 ZmMYB111和ZmMYB148的轉(zhuǎn)錄激活活性分析
    3.4 ZmMYB111和ZmMYB148的亞細(xì)胞定位
    3.5 苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶基因啟動(dòng)子的克隆
    3.6 酵母單雜交實(shí)驗(yàn)
    3.7 瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)
        3.7.1 苯丙氨酸解氨酶PAL的組織特異性表達(dá)
        3.7.2 苯丙氨酸解氨酶PAL啟動(dòng)子體外活性檢測(cè)
        3.7.3 瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)
4 討論與結(jié)論
    4.1 討論
        4.1.1 ZmMYB111和ZmMYB148具有R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的基本特征
        4.1.2 ZmMYB111和ZmMYB148可能參與苯丙烷代謝的調(diào)控
        4.1.3 瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)方法及受體材料的選擇
    4.2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄1：實(shí)驗(yàn)中所用載體圖譜
    附錄2:實(shí)驗(yàn)中所用培養(yǎng)基配方
    附錄3：構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)基因登錄號(hào)
致謝
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本文編號(hào)：2879020