【摘要】：隨著生活水平的提高,食品安全問題日益受到人們的關注,果蔬中農藥的殘留對人體健康構成威脅,為解決這一問題,可以通過微生物發(fā)酵的方法來降解農藥。本文主要研究有機磷農藥降解菌的篩選、菌株培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化、有機磷農藥降解酶的分離提純、酶學性質研究及其基因研究。利用96孔板法從長期噴灑農藥的耕地土壤中篩選出能高效降解有機磷農藥的菌株,并對其進行形態(tài)學、生理生化及分子生物學鑒定,結果表明:篩選的菌株為膠紅酵母菌(Rhodotorula muciaginosa),命名為RM-DY21,利用紫外分光光度法測定菌株RM-DY21在32 h內對毒死蜱(50mg/L)降解率可達70.04%,在以毒死蜱為唯一碳源的培養(yǎng)基中,RM-DY21生長較好,氧樂果次之,敵百蟲中較少,故說明菌株RM-DY21可以廣泛降解有機磷農藥。為提高Rhodotorula mucilauginosa RM-DY21對有機磷農藥的降解率,通過單因素及響應曲面分析,對培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。實驗確定了Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21最優(yōu)培養(yǎng)基配方為:乳糖20.0g/L,硫酸銨20.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,Ca2+、Mg2+、Zn2+的添加量分別為 0.8、0.6、0.8 mg/20mL 發(fā)酵液;利用 Design-expert 8.0軟件進行Box-Behnken中心組合設計原理分析實驗,確定初始pH 5.0,溫度30℃,培養(yǎng)36 h時,Rhodotorula mucilotonosa RM-DY21對有機磷農藥的降解率可達到83.86%,比優(yōu)化前提高了 10.62%,為后續(xù)菌株產酶研究的相關試驗奠定了良好的基礎。實驗對菌株Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所產有機磷降解酶進行定位,并采用鹽析及柱層析的方法對有機磷降解酶進行了分離純化。實驗結果表明,Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21菌株所產生的有機磷降解酶為胞外酶;通過硫酸銨分級沉淀,得到降解酶鹽析范圍為60%～80%(w/v);透析并濃縮后,用SephadexG-100葡聚糖凝膠進行層析,得到有機磷降解酶的比酶活為350.63 U/mg;再次透析濃縮后,用DEAE SepharoseFastFlow柱層析,0.2～0.5mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液進行洗脫,收集酶液測其比酶活為693.94 U/mg;通過SDS-PAGE變性凝膠電泳確定Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所產的有機磷降解酶分子量約40kDa。酶學性質研究發(fā)現,有機磷降解酶的反應溫度為30～50℃,其最適反應溫度為40℃;保存溫度在-20℃下最佳;反應pH為7～9,最適pH為8;最適反應時間為30 min;最適酶添加量為20 μL。不同金屬離子對有機磷降解酶的活性有不同的影響,0.2mmol/L的Na+、Zn2+對降解酶有較強的激活作用,而Ca2+、Mg2+的激活作用較弱;同濃度Li+、K+、Mn2+、Ag+對降解酶有較強的抑制作用,而Cu2+、Fe3+、Fe2+抑制作用較弱;異丙醇、丙酮對酶活性有抑制作用,乙醇隨著濃度的升高激活作用增加;高濃度的甲醇有微弱提高酶活作用,并測得其動力學參數 Km=24.213 μmol·L-1,Vmax=18.553 μmol·(mg·min)-1。參照GenBank中已收錄的有機磷降解酶基因序列,利用VectorNTI 10軟件分析并設計了 2對特異性引物,對實驗菌株的產有機磷降解酶基因進行PCR擴增測序,并利用相應軟件對其氨基酸序列進行分析。測序結果顯示,實驗菌株的有機磷降解酶基因序列與其他多種菌株的一致性較高,該opd基因含1155個核苷酸,編碼384個氨基酸,OPD蛋白的分子式為C1830H2944N530O540S11,分子量約為41363.39 Da,為疏水性穩(wěn)定蛋白,等電點為9.05,總原子數為5855,存在信號肽,屬于分泌型蛋白,二級結構具有0α螺旋(Hh)38.54%,延伸鏈(Ee)19.53%,β折疊(Tt)8.33%,無規(guī)則卷曲(Cc)33.59%;此酶以2r11.1.A(有機磷水解酶)序列為模板一致性達99.39%,覆蓋度86%,OPD蛋白三級結構含有2個銅原子,該酶將為今后基因工程菌的構建提供理論依據。
【學位授予單位】：哈爾濱商業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X172;X592;TQ925

【參考文獻】

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本文編號：2798944