【摘要】：目的:探討代謝型谷氨酸受體6(metabotropic glutamate receptor 6,mGluR6)對黑素細(xì)胞形態(tài)影響及其在黑素細(xì)胞-角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系中對黑素轉(zhuǎn)運的作用及其相關(guān)機(jī)制。方法:1.原代培養(yǎng)純化黑素細(xì)胞,合成慢病毒載體Lv-mGluR6-shRNA,對黑素細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并敲除mGlu R6表達(dá)。2.免疫印跡法(Western blotting)檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后mGlu R6的表達(dá)情況。3.掃描電鏡觀察Lv-mGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后黑素細(xì)胞的偽足及樹突形態(tài)變化。4.建立體外黑素細(xì)胞與HaCat角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體系。掃描電鏡觀察LvmGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后共培養(yǎng)體系中絲狀偽足連接的變化;NaOH法測定共培養(yǎng)體系中角質(zhì)形成細(xì)胞中的黑素含量;運用免疫熒光雙染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測黑素小體轉(zhuǎn)運效率。5.免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察Lv-mGluR6-shRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞骨架蛋白β-tublin的分布變化和共培養(yǎng)體系下黑素細(xì)胞在角質(zhì)形成細(xì)胞中分布含量的區(qū)別。結(jié)果:1.掃描電鏡發(fā)現(xiàn)黑素細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染后,樹突變短,二、三級樹突數(shù)量減少,細(xì)胞表面?zhèn)巫銛?shù)目明顯減少。2.黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞的共培養(yǎng)體系中,兩細(xì)胞間以絲狀偽足相連,轉(zhuǎn)染后的共培養(yǎng)體系中,相連接的絲狀偽足數(shù)量明顯減少。3.共培養(yǎng)48小時后,NaOH法測定轉(zhuǎn)染組角質(zhì)形成細(xì)胞中黑素含量明顯少于對照組。4.使用NKI/beteb抗體標(biāo)記黑素小體、廣譜細(xì)胞角蛋白抗體標(biāo)記角質(zhì)形成細(xì)胞,激光共聚焦顯微鏡觀察角質(zhì)形成細(xì)胞中分布黑素小體。與對照組相比,慢病毒轉(zhuǎn)染后角質(zhì)形成細(xì)胞中的黑素小體數(shù)目明顯減少;流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示黑素小體在角質(zhì)形成細(xì)胞中的含量隨時間遞增,與對照組相比,轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)運效率明顯下降。5.激光共聚焦顯微鏡觀察β-tublin抗體標(biāo)記的細(xì)胞骨架蛋白在轉(zhuǎn)染組和對照組有明顯差異;轉(zhuǎn)染組骨架蛋白呈點狀分布,不呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相連接;對照組骨架蛋白成管束狀分布均勻。結(jié)論:1.mGluR6的表達(dá)與黑素細(xì)胞骨架蛋白分布及黑素細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)。2.mGluR6的表達(dá)與共培養(yǎng)體系中絲狀偽足的形成有關(guān)。3.mGluR6的表達(dá)影響共培養(yǎng)體系中黑素小體的轉(zhuǎn)運。4.mGluR6的表達(dá)影響黑素小體的轉(zhuǎn)運,其可能機(jī)制為:(1)通過改變黑素細(xì)胞骨架蛋白分布和形態(tài)影響黑素小體轉(zhuǎn)運。(2)通過改變共培養(yǎng)體系中絲狀偽足的形成來影響黑素小體轉(zhuǎn)運。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R339.11

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本文編號：2797864