【摘要】：氯代乙酰胺類除草劑是一類具有高效性、高選擇性芽前除草劑。它們在全球范圍內(nèi)廣泛使用。其主要代表品種丁草胺和乙草胺,年使用量分別超過1萬噸和3萬噸,主要用于一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草的防除。該類除草劑對魚類有較強的毒性,其中丁草胺被美國環(huán)保局定為L2類致癌物。由于它們具有水溶性高、土壤殘留期長的特點,因此而導致的土壤殘留不僅影響后茬作物生長還造成生態(tài)污染,所以環(huán)境中氯代乙酰胺類除草劑的殘留引起人們的廣泛關注。已有研究表明微生物降解是消除環(huán)境中氯代乙酰胺類除草劑的主要方式。因此本文以丁草胺為底物,分離篩選高效氯代乙酰胺類除草劑降解菌株,研究其對丁草胺的代謝途徑及其克隆其中關鍵酶基因,從分子生物學水平上解析此類除草劑的降解機制。一、丁草胺降解菌株的分離和降解特性的研究以丁草胺為底物,以江蘇常州水稻田采集的土樣作為接種物,通過連續(xù)富集培養(yǎng)的方法得到兩個能夠降解丁草胺的富集液Yl和Y3,從富集液Y1中分離到菌株B1,從富集液Y3中分離到菌株B2和N7。根據(jù)菌株的表型、生理生化特性和16S rRNA基因同源比對,將菌株B1、B2初步鑒定為Rhodococcus sp.。菌株N7的分類地位在本文的最后一章研究。菌株B1在5天內(nèi)對100 mg/L丁草胺的降解率為100%。菌株B2在12h內(nèi)對100mg/L丁草胺的降解率為94%。菌株B1、B2降解丁草胺的最適溫度和pH都為30℃和7.0。0.1 mM的Ag+、Ca2+、Ni2+和Hg2+對菌株B1降解丁草胺具有較強的抑制作用,其中以Hg2+、Ag+抑制作用最為強烈。0.1 mM的Ag+、Ba2+、Co2+、Mn2+、Hg2+和Cu2+對菌株B2降解丁草胺具有較強的抑制作用,其中以Hg2+、Mn2+抑制作用最為強烈,而Mg2+則對菌株B1和B2降解丁草胺有一定程度的促進作用。在菌株B1、B2降解丁草胺的過程中,通過GC-MS檢測到的代謝產(chǎn)物是2',6'-二乙基-2-氯乙酰苯胺(CDEPA)。菌株B1、B2都不能繼續(xù)降解CDEPA。據(jù)此推測菌株B1、B2降解丁草胺通過切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵(Ⅳ-脫烷基作用來降解)。菌株B1能降解甲草胺、乙草胺、丙草胺和丁草胺,然而菌株B2只能降解乙草胺和丁草胺,菌株B1比菌株B2有更廣的降解譜。因此,雖然菌株B1和B2都能通過切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵來降解丁草胺,但是催化該過程的酶可能不一樣。在后續(xù)的研究中,我們將分別研究菌株B1、B2降解丁草胺的機制。菌株N7既不能降解丁草胺也不能降解CDEPA,但是它一直和菌株B2穩(wěn)定共存在富集液中。利用菌株B2降解丁草胺后的培養(yǎng)物(去除B2細胞)來培養(yǎng)菌株N7發(fā)現(xiàn)菌株N7的細胞濃度升高,據(jù)此推測菌株N7利用菌株B2降解丁草胺產(chǎn)生的除CDEPA以外的其他代謝產(chǎn)物生長。二、菌株B1中的丁草胺降解酶Ch1H的純化及特性研究基于菌株B1的粗酶液可以在含有丁草胺的瓊脂平板上因降解丁草胺而產(chǎn)生水解圈的特性建立了一種定性檢測丁草胺降解酶的方法。通過DEAE-Sepharose fast flow凝膠層析、Q-Sepharose fast flow凝膠層析和PAGE切膠回收電洗脫等純化手段得到具有較高的丁草胺降解活性的丁草胺降解酶Ch1H,整個過程丁草胺降解酶純化了185.1倍,酶的比活達到114.8 U/mg,最終得率為16.1%,分子量大小在45 KDa左右。Ch1H可以通過Ⅳ-脫烷基作用降解丁草胺生成CDEPA,初步推斷為一個水解酶。Ch1H部分特性如下：降解丁草胺的最適溫度為30℃,最適pH為7.0, 1.0mM Hg2+, Ca2+和Ni2+強烈抑制了降解酶Ch1H活性,1.0mM Fe2+對Ch1H有較強的抑制作用,1.0 mM的Mg2+有促進酶活的作用,酶活提高了1.1倍。降解酶Ch1H還可以降解甲草胺、乙草胺、丙草胺,Ch1H的最適底物為甲草胺,并且隨著底物苯胺環(huán)N上連接的側(cè)鏈長度的增加催化效率逐漸降低,水解效率為：甲草胺乙草胺丁草胺丙草胺。我們嘗試了蛋白質(zhì)N端測序等方法克隆編碼Ch1H的基因,令人遺憾的是沒有成功。在將來的研究中,我們將繼續(xù)開展這方面的工作。三、通過比較基因組的方法克隆菌株B2中與丁草胺降解相關的Ⅳ-脫烷基酶基因在LB平板上連續(xù)傳代菌株B1、B2的過程中,菌株B1的降解特性穩(wěn)定存在,而B2菌株會出現(xiàn)功能丟失的情況,我們將其丟失功能的一個突變株稱為TB2。采用Illumina MiSeq測序技術(shù)對菌株B2及突變菌株TB2進行基因組框架圖測序。菌株B2測序草圖信息如下：Scaffolds452個,堿基數(shù)量6,871,517 bp, ORFs 6,521個。菌株TB2測序草圖信息如下：Scaffolds 101個,堿基數(shù)量6,716,155 bp, ORFs 6,411個。利用Omiga 2.0軟件分析兩株菌的基因組差別,結(jié)果顯示在菌株B2中的scaffold51的末端大約30 K的片段在TB2中沒有比對到,以此序列的不同區(qū)域為基礎,設計四對引物,通過PCR的方法進一步驗證該片段在TB2中不存在。將菌株TB2中丟失的片段中所有可能的ORF編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列與NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫上的蛋白質(zhì)序列進行相似性比對,發(fā)現(xiàn)有一個基因簇由EthR、EthA、EthB、EthC、EthD五個基因構(gòu)成,其中EthR編碼屬于AraC/XylS家族的調(diào)節(jié)蛋白(37 KDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001 的 EthR (99%); EthA編碼鐵氧還蛋白還原酶組分(43 kDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthA (99%); EthB編碼細胞色素P450氧化酶組分(44 kDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthB (92%):EthC編碼2Fe-2S型鐵氧還蛋白組分(11 kDa),與其相似性最高的是Rhodococcus ruber IFP2001的EthC (99%); EthD編碼一個10 kDa的蛋白,與其相似性最高的是Rhodococcus ruberIFP2001的功能未知蛋白EthD (90%)。Rhodococcus ruber IFP2001是一株ETBE(乙基叔丁基醚)降解菌,它的EthRABCD基因簇負責ETBE的O上脫烷基功能(切斷C-O),因此,我們推測菌株B2的基因簇EthRABCD可能具有類似的脫烷基功能,即切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵(Ⅳ-脫烷基作用)。為了驗證基因簇EthRABCD的功能,將EthRABCD基因簇(含原始啟動子)克隆到穿梭載體pRESQ上,構(gòu)建重組質(zhì)粒pQEth1,將其導入突變株TB2,其恢復了降解丁草胺的功能。為此,我們認為菌株B2的基因簇EthRABCD就是負責切斷丁草胺分子中丁氧甲基和苯胺環(huán)上N原子之間的C-N鍵的功能(N-脫烷基作用),互補菌株TB2 (pQEthl)在不經(jīng)乙草胺誘導的情況下只能降解乙草胺和丁草胺,但是在乙草胺的誘導后還可以降解甲草胺和丙草胺。鑒于EthD在Rhodococcus ruber IFP2001菌株中是一個功能未知蛋白,我們又將EthRABC與pRESQ構(gòu)建了重組質(zhì)粒pQEth2,將其導入突變株TB2,它沒有恢復降解丁草胺的功能,說明基因EthD編碼的蛋白在降解中必不可少。其具體功能還需進一步研究。為了將EthABCD在大腸桿菌中表達,我們將其克隆到pET29a (+)上構(gòu)建重組質(zhì)粒(pET-EthABCD),將該質(zhì)粒導入菌株E. coli BL21中,使該菌獲得了降解乙草胺的功能,但活性很低。推測可能是由于密碼子偏嗜性導致的表達量過低。通過實時熒光定量PCR以EthB為靶標基因,測定了EthB在氯代酰胺類除草劑誘導和葡萄糖誘導條件下的轉(zhuǎn)錄情況,結(jié)果顯示EthB在甲草胺、乙草胺、丙草胺和丁草胺的誘導下,轉(zhuǎn)錄水平分別為葡萄糖誘導條件下的0.73倍,354倍,33倍和1.63倍,證明丁草胺和乙草胺可以誘導EthB的表達,其中乙草胺誘導效率最高。進一步研究發(fā)現(xiàn),基因簇EthRABCD中的每個基因都受乙草胺的誘導,在乙草胺的誘導下EthR、EthA、EthB、EthC和EthD的轉(zhuǎn)錄水平相比葡萄糖誘導下提分別提高了326倍、256倍、354倍、321倍和263倍。通過PCR的方法在B1菌株中沒有檢測到EthRABCD基因簇的存在,這進一步證明了在菌株B1和B2中存在不同基因編碼的酶來催化丁草胺的脫烷基作用。四、菌株N7分類地位的研究前文提到N7可以同菌株B2在以丁草胺為唯一碳源的富集液中穩(wěn)定存在,它是利用菌株B2降解丁草胺的產(chǎn)物生長。對其16S rRNA基因序列相似性分析顯示,菌株N7與Sphingobacterium multivorum IAM14316T的相似性為97.49%,與Sphingobacterium canadense CR11T的相似性為97.11%,與Sphingobacterium屬中的其他細菌的相似性低于97%,且在系統(tǒng)分類樹上菌株N7與Sphingobacterium multivorum IAM14316T、 Sphingobacterium canadense CR11T (AY787820) 和 Sphingobacterium siyangense SY1T(EU046272)構(gòu)成一個系統(tǒng)分類分支。N7的主要的呼吸醌是MK--7、主要的脂肪酸是iso-C15:0(25.49%), C16:0 (7.92%), iso-C17:0 3-OH (6.98%),和summed feature 3 (comprising C16:1ω6c 和/或 C16:1 ω7c; 42.08%)、G+C含量為40.9±0.5 mol%,菌株N7與Sphingobacterium multivorum IAM14316T和Sphingobacterium canadense CR11T的DNA同源性分別為21%和15%,遠低于70%(種間界定的閾值)。綜合其它的多相分類數(shù)據(jù)確定菌株N7為Sphingobacterium屬的一個新種,我們將其命名為Sphingobacterium changzhouense N7T (= CCTCC AB 2012100T= KACC 16854 T)。
【學位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：X592;X172

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本文編號：2622987