本文選題：皮膚　切入點(diǎn)：損傷愈合　出處：《中國(guó)醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 皮膚切創(chuàng)愈合過程是機(jī)體保持組織完整性而產(chǎn)生的一個(gè)連續(xù)而復(fù)雜的過程，大致分為三個(gè)階段，即炎癥期、增生期和組織重建期，有多種細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞參與。研究表明，皮膚損傷愈合過程中保持細(xì)胞數(shù)量的平衡是通過程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death)，即細(xì)胞凋亡(apoptosis)這一機(jī)制完成的[1]。我們的前期研究認(rèn)為caspase家族成員可能參與皮膚損傷愈合過程中多型核細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞這三種細(xì)胞的凋亡，并且caspase家族成員有望成為用于皮膚損傷時(shí)間推斷的指標(biāo)[4-5]。而且在皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase的表達(dá)、激活情況對(duì)參與損傷愈合中細(xì)胞凋亡的影響和對(duì)組織愈合的影響尚未見報(bào)道，也未見關(guān)于在體研究參與皮膚損傷愈合過程中細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究報(bào)道。 Q-VD-OPH(Quinolyl-Valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorophenoxyl]-rr,ethyl ketone)是一種優(yōu)于Z-VAD-fmk和Boc-D-fmk的廣譜抑制劑。本實(shí)驗(yàn)在切創(chuàng)的動(dòng)物模型體內(nèi)應(yīng)用caspase廣譜抑制劑O-VD—OPH，抑制caspase級(jí)聯(lián)的激活，從而抑制caspase活性，并且應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)、比色法、Western blotting和RT-PCR技術(shù)等方法檢測(cè)各組小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase-3，-6，-7蛋白的表達(dá)、激活情況和mRNA的表達(dá)情況，從而闡述皮膚損傷愈合過程中細(xì)胞凋亡的機(jī)制和凋亡細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 實(shí)驗(yàn)材料和方法 1．健康成年清潔級(jí)昆明系小鼠162只，體質(zhì)量30±2g，隨機(jī)分為3組：實(shí)驗(yàn)組(Q-VD-OPH組)、對(duì)照1組(DMSO組)、對(duì)照2組(NaCI組)。每組小鼠又分成0h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d時(shí)間段，每時(shí)間段6只小鼠。實(shí)驗(yàn)切口前30min小鼠腹腔注射相應(yīng)液體，乙醚氣體吸入麻醉，背部剪毛處理，常規(guī)手術(shù)消毒，在背部中央做一縱行長(zhǎng)1.5cm皮膚全層切口，深達(dá)筋膜。每24h重復(fù)給藥一次。分別于傷后不同時(shí)間將小鼠脫頸椎處死，取傷口處1.0cm×1.5cm皮膚組織。部分固定后石蠟包埋，5μm厚度連續(xù)切片。部分所取皮膚組織用冷生理鹽水清洗后置于液氮內(nèi)速凍，-70℃保存?zhèn)溆糜诘鞍子≯E分析和活性測(cè)定分析，部分用1‰DEPC水沖洗后用Trizol提取mRNA，用于RT-PCR分析。 2．常規(guī)H．E染色。 3．免疫組織化學(xué)染色(SP法)： 4．Western blotting分析； 5．Caspase-3，-6活性測(cè)定； 6．RT-PCR； 7．圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用OLYMPUS BX 51顯微照相攝像系統(tǒng)(日本)、計(jì)算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)(Meta Morph／DDIO／BX51)，×400倍下，在損傷區(qū)及損傷周邊區(qū)隨機(jī)選10個(gè)視野，計(jì)數(shù)包括多型核細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)。計(jì)算陽性細(xì)胞百分率，在SPSSll.O for windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)方差分析。 Western blotting和RT-PCR分析結(jié)果應(yīng)用Fluochem V2.0軟件(美國(guó)阿爾法公司，電泳凝膠圖像工作站)分析，作灰度掃描分析測(cè)定擴(kuò)增條帶灰度值，用內(nèi)參照β-actin修正比較各組表達(dá)水平的差異。結(jié)果采用方差分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第一部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中應(yīng)用caspase抑制劑后皮膚損傷愈合過程的病理形態(tài)學(xué)變化 Q-VD-OPH實(shí)驗(yàn)組愈合過程較對(duì)照組快。Q-VD-OPH組傷后6h出現(xiàn)多型核細(xì)胞浸潤(rùn)，12h內(nèi)可見大量浸潤(rùn)的炎細(xì)胞，1d可見多型核細(xì)胞數(shù)量減少，3d單個(gè)核細(xì)胞堆積，成纖維細(xì)胞增生。5d肉芽組織增生明顯。7d可見大量的單個(gè)核細(xì)胞和長(zhǎng)梭形細(xì)胞并可見大量的管腔樣結(jié)構(gòu)。傷后10d肉芽組織增生明顯，14d形成增生性瘢痕。 第二部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase抑制劑對(duì)caspase-3，-6，-7表達(dá)影響的免疫組織化學(xué)研究 對(duì)照組中caspase-3，-6，-7陽性表達(dá)主要存在于多型核細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中(細(xì)胞種類主要根據(jù)形態(tài)來區(qū)分)，并且各時(shí)間段相鄰兩組caspase-3，-6，-7陽性細(xì)胞率存在顯著性差別(P＜0.01)，Q-VD-OPH組還可見肉芽組織內(nèi)堆積的成纖維細(xì)胞大部分表達(dá)caspase-3陽性，陽性細(xì)胞率直至14d達(dá)到最高峰。而此時(shí)卻很少表達(dá)caspase-6，-7。實(shí)驗(yàn)組陽性細(xì)胞率與對(duì)照組存在顯著性差別(P＜0.01)。 第三部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase抑制劑對(duì)caspase-3，-6，-7表達(dá)及其剪切影響的蛋白印跡分析 對(duì)照組caspase-3，-6，-7的表達(dá)存在時(shí)間規(guī)律性。Q-VD-OPH組隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)，caspase-3前體表達(dá)逐漸增多，直至14d達(dá)高峰，但實(shí)驗(yàn)組未檢出caspase-3的活化片段；caspase-6，-7前體表達(dá)趨勢(shì)同對(duì)照組，但雜交強(qiáng)度明顯降低，而且只在1d-7d組檢出少量活化片段。與對(duì)照組存在顯著性差異。 第四部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中oaspase抑制劑對(duì)caspase-3，-6剪切及其活性變化的研究 對(duì)照組caspase-3活性倍數(shù)增值在12h和10d分別達(dá)高峰，Q-VD-OPH組對(duì)caspase-3的活性完全抑制。對(duì)照組caspase-6活性倍數(shù)增值在3d達(dá)高峰，Q-VD-OPH部分抑制了caspase-6的活性，與對(duì)照組各時(shí)間段相比均有顯著性差異。 第五部分：小鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中caspase抑制劑對(duì)caspase-3，-6，7 mRNA表達(dá)水平影響的研究 對(duì)各組各時(shí)間段樣本進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行相對(duì)灰度測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組caspase-3，-6，-7mRNA的表達(dá)存在時(shí)間規(guī)律性。Q-VD-OPH組隨損傷時(shí)間延長(zhǎng)，caspase-3mRNA表達(dá)逐漸增多，直至14d達(dá)高峰；caspase-6，-7mRNA表達(dá)趨勢(shì)同對(duì)照組，但雜交強(qiáng)度明顯降低。表明Q-VD-OPH可以影響caspase-3，-6，-7 mRNA的合成。 討論 近年的研究表明，caspase是負(fù)責(zé)執(zhí)行凋亡細(xì)胞中特異性酶切的關(guān)鍵蛋白酶，caspase蛋白酶家族是一類細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子家族，當(dāng)受到一定的信號(hào)刺激后通過蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)順序激活，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。結(jié)合近年來的研究結(jié)果，提示caspase-3，-6，-7極有可能是皮膚損傷愈合過程中誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行因子。為進(jìn)一步闡述caspase家族成員在皮膚損傷愈合過程中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的作用，應(yīng)用caspase抑制劑人為抑制其剪切和激活，觀察皮膚損傷愈合過程的變化和細(xì)胞凋亡的情況。 Q-VD-OPH作為新型的caspase廣譜抑制劑，通過抑制上游的啟動(dòng)型caspase而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用。本實(shí)驗(yàn)以前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，通過在體應(yīng)用Q-VD-OPH研究皮膚損傷愈合過程中細(xì)胞的凋亡機(jī)制，探討Q-VD-OPH對(duì)caspase-3，-6，-7的抑制情況和對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。 本實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照皮膚中檢出caspase-3前體的表達(dá)，表明casapse-3可能參與表皮基底層角朊細(xì)胞(kerotinocyte)的凋亡，并參與皮膚穩(wěn)態(tài)的維持。而且還檢出caspase-6的活性裂解片斷，說明caspase-6在正常皮膚中發(fā)揮維持穩(wěn)態(tài)和執(zhí)行皮膚新陳代謝相關(guān)的細(xì)胞凋亡的作用。 一、皮膚損傷愈合過程中中性粒細(xì)胞凋亡的機(jī)制 皮膚損傷愈合的早期，caspase-3、-6、-7被激活，尤其是在中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的高峰時(shí)相內(nèi)caspase-3的活性最高，說明在中性粒細(xì)胞的凋亡過程中caspase-3的激活發(fā)揮主要的作用。應(yīng)用Q-VD-OPH后，caspase-3的激活被抑制，但中性粒細(xì)胞仍舊不發(fā)生堆積。說明其自發(fā)性凋亡還存在非caspase-3途徑，存在其他代償性途徑發(fā)揮執(zhí)行細(xì)胞凋亡的作用。 二、皮膚損傷愈合過程中單核細(xì)胞凋亡的機(jī)制 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明對(duì)照組中浸潤(rùn)和增生的單個(gè)核細(xì)胞中有caspase-3，-6，-7的表達(dá)，caspase-3，-6，-7的激活在單個(gè)核細(xì)胞的凋亡過程中發(fā)揮重要作用。Q-VD-OPH抑制caspase-8，-9，-12的活性，并且抑制了caspase-3，-6，-7的活化。由于在Q-VD-OPH組內(nèi)，，單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)和增生的高峰時(shí)相內(nèi)caspase-3的激活完全被抑制，但可檢出caspase-6，-7的活性片段，說明caspase-6，-7激活不單純由上游因子caspase-8，-9，-12刺激激活，或者我們使用的抑制劑濃度并未完全抑制caspase家族成員的活性，而且在單核細(xì)胞的凋亡過程中caspase-6，-7可能不起主要作用。 三、caspase-3，-6，-7在成纖維細(xì)胞凋亡和增生性瘢痕形成過程中的作用 caspase-3的激活在晚期肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮主要作用。caspase-6，-7亦參與成纖維細(xì)胞的凋亡。應(yīng)用caspase抑制劑后，caspase-3激活片段完全被抑制，引起成纖維細(xì)胞大量堆積。Q-VD-OPH組內(nèi)在10d和14d時(shí)間段上caspase-6，-7的激活被抑制進(jìn)一步說明了caspase-6，-7的激活在成纖維細(xì)胞的凋亡和增生性瘢痕的形成過程中發(fā)揮重要的作用。 四、caspase-3，-6，-7在皮膚損傷愈合時(shí)間推斷上的應(yīng)用 皮膚損傷愈合過程中caspase-3，-6，-7的陽性細(xì)胞率、Western blotting和caspase-3，-6以及RT-PCR結(jié)果表明caspase-3，-6，-7基因和蛋白的表達(dá)水平上存在時(shí)間規(guī)律性，進(jìn)一步證實(shí)了caspase-3，-6，-7在皮膚損傷時(shí)間推斷上的應(yīng)用價(jià)值。 五、DMSO對(duì)皮膚損傷愈合的影響及對(duì)caspaso活性的影響 DMSO可以較低程度地抑制caspase-3，-6，-7前體的表達(dá)和激活，其中對(duì)caspase-3的抑制作用較弱，而對(duì)CaSpase-6的抑制作用相對(duì)較強(qiáng)。 結(jié)論 1．皮膚切創(chuàng)愈合過程中應(yīng)用Q-VD-OPH后造成皮膚的異常愈合，形成增生性瘢痕； 2．皮膚切創(chuàng)愈合過程中，Q-VD-OPH抑制單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的凋亡過程，導(dǎo)致該類細(xì)胞的堆積，但并未影響浸潤(rùn)的多型核細(xì)胞數(shù)目的減少； 3．皮膚切創(chuàng)愈合過程中Q-VD-OPH抑制caspase-3的激活，增加了caspase-3基因與前體的表達(dá)； 4．皮膚切創(chuàng)愈合過程中Q-VD-OPH抑制caspase-6，-7基因和前體的表達(dá)與激活； 5．皮膚切創(chuàng)愈合過程中組織中浸潤(rùn)的中性粒細(xì)胞的凋亡可能與caspase-3的激活相關(guān)，當(dāng)其激活被抑制時(shí)，可能出現(xiàn)其他代償性途徑執(zhí)行細(xì)胞凋亡； 6．caspase-3的激活可能是執(zhí)行皮膚切創(chuàng)愈合過程中組織中單個(gè)核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子；caspase-6，-7激活不單純由上游因子刺激激活，并且caspase-6，-7可能不是執(zhí)行單核細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子； 7．DMSO可以較低程度的抑制caspase-3，-6，-7的表達(dá)和激活。其中對(duì)caspase-3的抑制作用較弱，對(duì)caspase-6的抑制作用較強(qiáng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：D919

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 莊華梅;高溫對(duì)抗性和敏感小菜蛾caspase基因和hsp70基因熱激表達(dá)及抗性進(jìn)化的影響[D];福建農(nóng)林大學(xué);2010年

本文編號(hào)：1716986