發(fā)布時(shí)間：2024-03-25 22:18

　　YY1作為一個(gè)多功能的轉(zhuǎn)錄因子,根據(jù)其招募的輔助因子激活或抑制基因表達(dá)。YY1的C-末端由四個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)組成,并負(fù)責(zé)其與DNA結(jié)合。然而,YY1四個(gè)鋅指各自對(duì)其功能的影響尚未完全闡明。在本研究中,利用丙氨酸取代YY1中鋅指與DNA結(jié)合所必需的半胱氨酸,研究半胱氨酸突變對(duì)YY1與DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性的影響,以及對(duì)YY1在促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞增殖中的作用。得出如下結(jié)果:1.在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化野生型(wt)和突變體YY1蛋白,在這些YY1突變體中,每個(gè)鋅指中的兩個(gè)半胱氨酸被丙氨酸單獨(dú)或同時(shí)取代。設(shè)計(jì)并合成帶有YY1結(jié)合位點(diǎn)的wt探針和帶有突變序列的探針,利用凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YY1 wt和突變體蛋白與探針的結(jié)合親和力。鋅指2和3中半胱氨酸被丙氨酸取代的YY1突變體蛋白完全喪失了與wt探針的結(jié)合能力。與wt YY1蛋白相比,YY1鋅指1和4突變所產(chǎn)生的YY1突變體蛋白與wt探針結(jié)合顯著降低。2.YY1 wt和突變體表達(dá)質(zhì)粒分別與構(gòu)建的CDC6啟動(dòng)子啟動(dòng)Gaussia熒光素酶(Gluc)的表達(dá)報(bào)告載體共同轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中,然后對(duì)Gluc活性進(jìn)行檢測(cè)。與wt YY1相比,...

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 引言
    1.2 YY1基因
        1.2.1 YY1概述
        1.2.2 YY1與癌癥
        1.2.3 YY1鋅指的功能
    1.3 論文的研究目的及其研究意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 載體質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 慢病毒的包裝與侵染
        2.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
        2.2.4 蛋白表達(dá)及純化
        2.2.5 圓二色性光譜實(shí)驗(yàn)
        2.2.6 電泳遷移率實(shí)驗(yàn)
        2.2.7 Gluc熒光素酶活性檢測(cè)
        2.2.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)
        2.2.9 細(xì)胞增殖測(cè)定
        2.2.10 實(shí)時(shí)定量PCR
        2.2.11 引物設(shè)計(jì)
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 YY1蛋白與DNA結(jié)合分析
    3.2 YY1突變體的結(jié)構(gòu)分析
    3.3 YY1半胱氨酸突變體對(duì)CDC6轉(zhuǎn)錄活性的影響
    3.4 YY1雙半胱氨酸突變體對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和基因表達(dá)的影響
    3.5 本章小結(jié)
討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝
附件



本文編號(hào)：3938926