Rcl1是一個在酵母中首次被發(fā)現(xiàn)并研究的核仁蛋白,在真核生物中具有較高保守性,并作為SSU組裝復合體的組份,參與rRNA的加工過程。此外,在人細胞系中也證實RCL1的缺失影響了 rRNA的加工過程。本課題以斑馬魚作為模式生物,對Rcl1在脊椎動物中的功能進行研究。斑馬魚rcl1基因是一個母源基因。在卵子發(fā)育時大量儲存于成熟的卵細胞中,并在受精后表達水平下降,隨著胚胎發(fā)育出現(xiàn)一個全身性的表達小高峰,之后伴隨表達水平下降表現(xiàn)出消化器官組織特異性的表達模式。在消化器官如肝臟中,Rcl1定位于核仁中。我們運用兩個獨立的rcl1突變體品系:假性逆轉錄病毒插入導致的rcl1lacZ突變體以及利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)產(chǎn)生移碼突變的rcl1cas9突變體,檢測Rcl1缺失對斑馬魚早期胚胎發(fā)育的影響。發(fā)現(xiàn)由于Rcl1的缺失,源自內(nèi)胚層的肝臟、腸道、胰腺、膽囊、魚鰾以及下顎咽弓軟骨的生長發(fā)育受到嚴重阻滯。此外,其他胚層來源的器官發(fā)育也受到Rcl1缺失的影響,但沒有內(nèi)胚層器官嚴重。同時,確認Rcl1在肝臟、胰腺等芽基生長、擴張中具有重要作用。當缺乏Rcl1時,肝實質(zhì)細胞無法順利從G2期晚期進入...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞表
第1章 緒論
    1.1 模式生物斑馬魚
        1.1.1 模式生物斑馬魚簡介
        1.1.2 斑馬魚遺傳學突變技術簡介
        1.1.3 斑馬魚肝臟發(fā)育
    1.2 核仁及rRNA的加工
        1.2.1 核仁結構及其功能
        1.2.2 核糖體大小亞基
        1.2.3 rRNA加工在酵母和人中的差異
    1.3 rcl1基因研究進展
第2章 材料與方法
    2.1 斑馬魚實驗
        2.1.1 斑馬魚飼養(yǎng)與繁殖
        2.1.2 斑馬魚品系
        2.1.3 斑馬魚胚胎顯微注射(microinjection)
    2.2 常規(guī)生化試劑及其配制
    2.3 DNA相關實驗方法
        2.3.1 斑馬魚基因組DNA制備
        2.3.2 基因克隆
        2.3.3 細胞凋亡實驗
    2.4 RNA相關實驗方法
        2.4.1 總RNA提取
        2.4.2 DNase I去除RNA樣品中的DNA
        2.4.3 逆轉錄實驗
        2.4.4 實時熒光定量PCR
        2.4.5 mRNA體外轉錄實驗
        2.4.6 RACE實驗
        2.4.7 轉錄組學分析
        2.4.8 Northern印跡法(Northern blot)
        2.4.9 整胚原位雜交(WISH)
    2.5 蛋白質(zhì)相關實驗方法
        2.5.1 蛋白樣品的制備
        2.5.2 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
        2.5.3 蛋白免疫熒光技術(Immunofluorescence technique)
第3章 斑馬魚rcl1基因及其轉錄本研究
    3.1 rcl1基因產(chǎn)物同源性比較
    3.2 斑馬魚rcl1基因概述
    3.3 斑馬魚rcl1轉錄本在胚胎期的表達研究
第4章 斑馬魚Rcl1蛋白的抗體制備及其蛋白表達研究
    4.1 斑馬魚Rcl1蛋白抗體的制備
    4.2 斑馬魚Rcl1蛋白抗體的檢測
    4.3 斑馬魚Rcl1蛋白在胚胎期的表達研究
第5章 斑馬魚rcl1^lacZ和rcl1^cas9突變體的獲得及其表型的描述
    5.1 斑馬魚rcl1^lacZ突變體的獲得
    5.2 斑馬魚rcl1^cas9突變體的獲得
    5.3 斑馬魚rcl1突變體中rcl1基因轉錄水平及Rcl1蛋白水平的驗證
    5.4 斑馬魚rcl1突變體中消化器官生長發(fā)育受到阻滯
    5.5 斑馬魚rcl1突變體中其他器官的發(fā)育受到一定影響
第6章 斑馬魚rcl1突變體細胞增殖受阻導致小肝臟表型
    6.1 斑馬魚rcl1突變體肝實質(zhì)細胞的細胞周期受到阻滯
    6.2 斑馬魚rcl1突變體肝實質(zhì)細胞無異常凋亡現(xiàn)象
第7章 斑馬魚Rcl1的缺失影響18S rRNA的加工和成熟過程
    7.1 斑馬魚rcl1突變體中18S rRNA大量減少
    7.2 斑馬魚rcl1突變體中18S rRNA前體剪切出現(xiàn)異常
    7.3 體外酶活實驗探究Rcl1的內(nèi)切酶活性
第8章 斑馬魚rcl1^cas9突變體轉錄組學分析
    8.1 測序樣品的選定及其制備
    8.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估
    8.3 轉錄組基因表達量計算及差異表達基因分析
    8.4 通過qRT-PCR實驗對測序結果進行驗證
    8.5 GO功能分析
    8.6 代謝通路分析
    8.7 可變剪切分析
第9章 斑馬魚bms1基因的相關研究
    9.1 斑馬魚bms1l^zjul突變體的獲得
    9.2 斑馬魚Bms11蛋白抗體的制備
    9.3 斑馬魚Bms11蛋白抗體的檢測
    9.4 Bms11蛋白在SDS-PAGE上的分子量同其理論分子量的差異研究
第10章 結論與討論
    10.1 結論
    10.2 討論
第11章 參考文獻
作者簡介
致謝



本文編號：3872600