寨卡病毒(ZIKA Virus,ZIKV)是一種主要通過伊蚊傳播的RNA病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬中的成員。該病毒于1947年首次分離于烏干達地區(qū)的寨卡森林。ZIKV大多數(shù)感染者表現(xiàn)為無癥狀或僅有輕微癥狀,孕婦感染ZIKV可以將病毒傳播給胎兒,致使新生兒患有先天性嚴重小頭畸形和神經(jīng)系統(tǒng)缺陷,同時還可以引起早產(chǎn)或流產(chǎn)。成年人感染ZIKV會引起一種罕見的嚴重自身免疫性疾病-格林-巴利綜合征。在第一次有記載的太平洋島發(fā)生人感染ZIKV案例和近期南美ZIKV流行性感染暴發(fā)并迅速傳播至全球60多個國家之前,該病毒并未受到關(guān)注。最近在中美洲和南美洲爆發(fā)的疫情引起了公眾對ZIKV感染的廣泛關(guān)注,對ZIKV的研究也有一些新的進展。然而,ZIKV與宿主細胞互作的機制尚未確定,針對ZIKV的疫苗或治療ZIKV感染的藥物尚未研制成功。在本實驗室對KPNA6和ZIKV互作機制的研究中發(fā)現(xiàn),ZIKV感染宿主細胞可以引起核轉(zhuǎn)運蛋白KPNA6的表達升高,KPNA6基因敲除可以抑制ZIKV的復(fù)制。在應(yīng)用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析未感染和ZIKV感染樣品的實驗中,篩選出ZIKV感染后降低的多個蛋白,其中,KPNA2在ZIKV感染后...

【文章頁數(shù)】：136 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
英文縮寫詞表
引言
第一篇 文獻綜述
    第1章 寨卡病毒研究進展
        1.1 ZIKV分子生物學(xué)及病毒學(xué)特征
            1.1.1 ZIKV病毒學(xué)分類
            1.1.2 ZIKV形態(tài)結(jié)構(gòu)和理化特性
            1.1.3 ZIKV基因組結(jié)構(gòu)及功能
        1.2 ZIKV生命周期
        1.3 ZIKV致病機制
            1.3.1 ZIKV感染的趨向性
            1.3.2 ZIKV感染導(dǎo)致細胞死亡的機制
            1.3.3 宿主細胞限制因子干擾ZIKV病毒復(fù)制的機制
            1.3.4 ZIKV的免疫逃避機制
        1.4 ZIKV的預(yù)防與治療
    第2章 核輸入蛋白
        2.1 核定位信號
        2.2 核運輸體系
            2.2.1 核孔復(fù)合物
            2.2.2 核胞質(zhì)轉(zhuǎn)運體
            2.2.3 Ran GTPase
        2.3 經(jīng)典核蛋白導(dǎo)入的分子機制
        2.4 核輸入蛋白KPNA的生物學(xué)功能
    第3章 伴侶分子介導(dǎo)的自噬
        3.1 CMA的發(fā)現(xiàn)
        3.2 CMA的分子機制
            3.2.1 貨物分子的選擇
            3.2.2 HSC70 參與CMA通路
            3.2.3 溶酶體受體LAMP2A的功能
        3.3 CMA在生理學(xué)中的意義
        3.4 CMA的臨床意義
            3.4.1 CMA抵抗衰老的作用
            3.4.2 CMA在神經(jīng)退行性疾病中的意義
            3.4.3 CMA在癌癥中的意義
第二篇 研究內(nèi)容
    第1章 寨卡病毒對核輸入蛋白KPNA2的影響
        1.1 材料
            1.1.1 細胞、病毒、試劑、抗體
            1.1.2 主要儀器
        1.2 方法
            1.2.1 ZIKV病毒的繁殖
            1.2.2 Western Blot檢測KPNA2 蛋白水平
            1.2.3 RT-q PCR檢測KPNA2 m RNA水平
            1.2.4 不同細胞系KPNA2蛋白水平的檢測
            1.2.5 Western Blot檢測感染時間和感染復(fù)數(shù)對KPNA2 的影響
            1.2.6 圖像處理及統(tǒng)計分析
        1.3 結(jié)果
            1.3.1 ZIKV感染對KPNA2 水平的影響
            1.3.2 ZIKV感染時間和感染復(fù)數(shù)對KPNA2 的影響
        1.4 討論
        1.5 小結(jié)
    第2章 核輸入蛋白KPNA2的降解途徑
        2.1 材料
            2.1.1 細胞、病毒、試劑、抗體、載體
            2.1.2 主要儀器
        2.2 方法
            2.2.1 KPNA2蛋白降解部位的確定
            2.2.2 細胞活力測定實驗檢測MG132和NH4CL對細胞活力的影響
            2.2.3 RT-q PCR檢測MG132和NH4CL對 ZIKV感染的影響
            2.2.4 KPNA2蛋白半衰期的檢測
            2.2.5 免疫共沉淀檢測KPNA2泛素化水平
            2.2.6 免疫共沉淀檢測KPNA2與LAMP2A相互作用
            2.2.7 激光共聚焦檢測KPNA2與LAMP2A共定位
            2.2.8 LAMP2A敲降細胞系的建立
            2.2.9 細胞活力測定實驗檢測LAMP2A敲降細胞的活力
            2.2.10 檢測LAMP2A敲降細胞內(nèi)ZIKV感染對KPNA2 水平的影響
            2.2.11 圖像處理及統(tǒng)計分析
        2.3 結(jié)果
            2.3.1 KPNA2蛋白降解部位的確定
            2.3.2 ZIKV對 KPNA2 半衰期的影響
            2.3.3 ZIKV感染對KPNA2 泛素化水平的影響
            2.3.4 免疫共沉淀對KPNA2與LAMP2A相互作用的檢測
            2.3.5 激光共聚焦對KPNA2與LAMP2A相互作用的檢測
            2.3.6 LAMP2A敲降對KPNA2 的影響
            2.3.7 LAMP2A敲降對ZIKV病毒導(dǎo)致的KPNA2 降低的影響
        2.4 討論
        2.5 小結(jié)
    第3章 ZIKV非結(jié)構(gòu)蛋白NS2A對 KPNA2 降解作用機制
        3.1 材料
            3.1.1 細胞、病毒、試劑、抗體、載體
            3.1.2 主要儀器
        3.2 方法
            3.2.1 寨卡病毒蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.2 Western Bolt檢測寨卡病毒蛋白對KPNA2 蛋白表達水平的影響
            3.2.3 不同劑量NS2A對 KPNA2 蛋白表達水平的影響
            3.2.4 ZIKV NS2A與 KPNA2 之間相互作用的檢測
            3.2.5 LAMP2A敲降對ZIKV NS2A和 KPNA2 相互作用的影響
            3.2.6 細胞活力測定實驗檢測NS2A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對HEK293 細胞的影響
            3.2.7 ZIKV NS2A蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測及質(zhì)粒構(gòu)建
            3.2.8 ZIKV NS2A截短突變體對KPNA2 重組蛋白表達的影響
            3.2.9 ZIKV NS2A點突變體的構(gòu)建
            3.2.10 ZIKV NS2A點突變體對KPNA2 重組蛋白表達的影響
            3.2.11 免疫共沉淀驗證T100A點突變對NS2A與 KPNA2 之間相互作用的影響
            3.2.12 T100A點突變對ZIKV病毒復(fù)制的影響
            3.2.13 圖像處理及統(tǒng)計分析
        3.3 結(jié)果
            3.3.1 ZIKV病毒蛋白對KPNA2 表達水平的影響
            3.3.2 ZIKV NS2A與 KPNA2 之間的相互作用
            3.3.3 LAMP2A敲除對NS2A與 KPNA2 相互作用的影響
            3.3.4 ZIKV NS2A截短突變體對KPNA2 重組蛋白表達的影響
            3.3.5 ZIKV NS2A點突變體對KPNA2 重組蛋白表達的影響
            3.3.6 NS2A點突變對NS2A與 KPNA2 相互作用的影響
            3.3.7 NS2A點突變感染性克隆的構(gòu)建及點突變病毒株的拯救
            3.3.8 NS2A點突變對ZIKV復(fù)制的影響
            3.3.9 NS2A點突變對ZIKV感染的細胞中KPNA2 蛋白水平的影響
        3.4 討論
        3.5 小結(jié)
    第4章 核輸入蛋白KPNA2對寨卡病毒復(fù)制的影響
        4.1 材料
            4.1.1 細胞、病毒、試劑、抗體、載體
            4.1.2 主要儀器
        4.2 方法
            4.2.1 KPNA2點突變體的構(gòu)建
            4.2.2 KPNA2 點突變對KPNA2 表達水平的影響
            4.2.3 KPNA2 點突變對KPNA2和LAMP2A相互作用的影響
            4.2.4 KPNA2 點突變對KPNA2和NS2A相互作用的影響
            4.2.5 KPNA2 敲降對ZIKV病毒復(fù)制的影響
            4.2.6 KPNA2敲降對細胞活力的影響
            4.2.7 圖像處理及統(tǒng)計分析
        4.3 結(jié)果
            4.3.1 KPNA2 點突變對KPNA2 表達水平的影響
            4.3.2 KPNA2 點突變對KPNA2和LAMP2A相互作用的影響
            4.3.3 KPNA2 點突變對KPNA2和NS2A相互作用的影響
            4.3.4 KPNA2 敲降對ZIKV病毒復(fù)制的影響
        4.4 討論
        4.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻
導(dǎo)師簡介
作者簡介
致謝



本文編號：3871339