基因工程方法實(shí)施藍(lán)藻溫度補(bǔ)償突變體nktc1分子鑒定的研究
發(fā)布時(shí)間：2023-11-24 21:30
藍(lán)藻Synechococcus elongatus PCC 7942(S.elongatus PCC 7942)是研究生物鐘節(jié)律性的最簡(jiǎn)單模式生物之一,其基因組中絕大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)都受到內(nèi)源生物鐘的調(diào)控。Kai ABC基因簇編碼了該種藍(lán)藻生物鐘核心震蕩器的基本分子組件,在藍(lán)藻生物鐘節(jié)律性的分子調(diào)控過程中起著至關(guān)重要作用。溫度補(bǔ)償特性是所有已知生物鐘模型的基本屬性之一,人們?cè)谝运{(lán)藻S.elongatus PCC 7942為對(duì)象的生物鐘節(jié)律性研究中發(fā)現(xiàn),溫度補(bǔ)償屬性的產(chǎn)生與維持往往與Kai基因家族的功能緊密相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中篩選得到一個(gè)Kai ABC基因簇序列完好,但生物節(jié)律性溫度補(bǔ)償屬性表型為溫度條件型的藍(lán)藻突變體nktc1(Non-Kai Thermo-regulatory Component 1)。本論文以實(shí)驗(yàn)室保存的藍(lán)藻S.elongatus PCC7942的nktc1突變體為對(duì)象采取基因工程方法對(duì)其溫度補(bǔ)償異常表型的分子機(jī)制進(jìn)行了初步探究。本論文的具體研究?jī)?nèi)容如下:1.首先基于基因組測(cè)序和基因克隆的方法確定了nktc1的突變位點(diǎn)。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明nktc1突變體的準(zhǔn)確...
【文章頁(yè)數(shù)】：128 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
1.1 藍(lán)藻生物鐘研究進(jìn)展
1.1.1 藍(lán)藻生物鐘Kai核心震蕩器的研究進(jìn)展
1.1.2 藍(lán)藻Kai生物鐘的離體震蕩研究進(jìn)展
1.1.3 與Kai生物節(jié)律性震蕩器相關(guān)的其他生物鐘組件研究進(jìn)展
1.2 溫度信號(hào)在藍(lán)藻生物鐘運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控中作用的研究進(jìn)展
1.2.1 環(huán)境溫度信號(hào)可以影響生物鐘相位牽引的過程
1.2.2 生物鐘節(jié)律性的溫度補(bǔ)償特性研究進(jìn)展
1.2.3 環(huán)境溫度條件對(duì)生物節(jié)律性的限制作用研究進(jìn)展
1.3 非Kai生物鐘溫度調(diào)控因子突變體nktc1(Non-Kai thermo-regulatory component,nktc1)
1.4 本論文的主要研究?jī)?nèi)容
第二章 nktc1藍(lán)藻突變體突變位點(diǎn)的確定
2.1 引言
2.2 材料與方法
2.2.1 材料
2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.2.1.2 主要試劑
2.2.1.3 主要儀器設(shè)備
2.2.2 方法
2.2.2.1 全基因組測(cè)序初步檢測(cè)和定位nktc1突變體的突變位點(diǎn)
2.2.2.2 使用基因工程手段對(duì)基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行克隆測(cè)序,并驗(yàn)證其真實(shí)性
2.2.2.2.1 分子克隆中用到的引物
2.2.2.2.2 目的基因片段的PCR擴(kuò)增體系及程序
2.2.2.2.3 PCR產(chǎn)物的測(cè)序和在線序列信息比對(duì)
2.3 結(jié)果
2.3.1 nktc1突變體基因組中的突變位點(diǎn)分析
2.3.1.1 nktc1突變體藍(lán)藻全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的潛在突變位點(diǎn)分析
2.3.1.2 誘變親本藍(lán)藻S149全基因組測(cè)序SNP位點(diǎn)分析
2.3.1.3 全基因組測(cè)序結(jié)果的比較分析
2.3.2 假定nktc1突變位點(diǎn)的分子克隆及測(cè)序驗(yàn)證
2.3.2.1 不同藻株中CikA基因表達(dá)框序列比對(duì)結(jié)果
2.3.2.1.1 藍(lán)藻數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的野生型CikA基因表達(dá)框序列
2.3.2.1.2 藍(lán)藻S149經(jīng)PCR克隆得到的CikA基因表達(dá)框序列
2.3.2.1.3 nktc1 突變體中經(jīng)PCR克隆得到的nktc-cikA突變基因ORF序列測(cè)序結(jié)果
2.3.2.2 不同藻株中RpaA序列測(cè)序結(jié)果
2.3.2.2.1 藍(lán)藻數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的野生型RpaA基因序列
2.3.2.2.2 基因克隆測(cè)序得到S149內(nèi)RpaA序列
2.3.2.2.3 基因克隆測(cè)序得到nktc1內(nèi)PCR克隆測(cè)序結(jié)果如下RpaA序列
2.4 討論
第三章 nktc1 突變回復(fù)藍(lán)藻藻株的基因工程構(gòu)建及單一nktc位點(diǎn)突變重構(gòu)藻株的獲得
3.1 引言
3.2 材料及方法
3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
3.2.2.1 攜帶nktc-cikA突變位點(diǎn)的藍(lán)藻轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
3.2.2.2 攜帶nktc-rpaA突變位點(diǎn)的藍(lán)藻轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
3.2.2.3 nktc-cikA突變?cè)换貜?fù)載體的構(gòu)建
3.2.2.4 nktc-rpaA突變?cè)换貜?fù)載體的構(gòu)建
3.2.2.5 突變重建藍(lán)藻藻株和突變回復(fù)藍(lán)藻藻株的獲得
3.3 結(jié)果
3.3.1 nktc-cikA或 nktc-rpaA突變位點(diǎn)重建載體及nktc突變位點(diǎn)回復(fù)載體的構(gòu)建
3.3.1.1 nktc-cikA突變重建載體的構(gòu)建及nktc-cikA突變位點(diǎn)重構(gòu)藍(lán)藻藻株的驗(yàn)證
3.3.1.2 nktc-rpaA突變重建載體的構(gòu)建及nktc-rpaA突變位點(diǎn)重構(gòu)藍(lán)藻藻株的驗(yàn)證
3.3.1.3 nktc-cikA突變?cè)换貜?fù)載體19T-CikA-R的構(gòu)建
3.3.1.4 nktc-rpaA突變?cè)换貜?fù)載體19T-RpaA-R的構(gòu)建
3.3.1.5 nktc1 突變體的異位回復(fù)株系NS-CikA-R和 NS-RpaA-R及異位雙回復(fù)株系的NS-CikA-RpaA-R的驗(yàn)證
3.4 討論
第四章 nktc-cikA和 nktc-rpaA突變對(duì)藍(lán)藻生物鐘節(jié)律性溫度補(bǔ)償表型的影響分析
4.1 引言
4.2 材料與方法
4.2.1 材料
4.2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
4.2.1.2 主要試劑
4.2.1.3 主要儀器設(shè)備
4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
4.2.2.1 RT-qPCR檢測(cè)KaiC基因在不同藍(lán)藻株系中的時(shí)序表達(dá)模式
4.2.2.1.1 不同藍(lán)藻株系在溫度馴化條件下時(shí)序樣本的收集
4.2.2.1.2 TRIzol法進(jìn)行總RNA的提取
4.2.2.1.3 基因組DNA的去除及c DNA的合成與純化
4.2.2.1.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)
4.2.2.2 Western Blot檢測(cè)KaiC蛋白磷酸化節(jié)律性在不同藍(lán)藻藻株中的表型
4.2.2.2.1 用于Western Blot實(shí)驗(yàn)蛋白提取的藍(lán)藻時(shí)序樣本收集
4.2.2.2.2 藍(lán)藻蛋白的提取
4.2.2.2.3 蛋白電泳
4.2.2.2.4 Western blot
4.3 結(jié)果
4.3.1 KaiC基因在野生型藍(lán)藻S149中的表達(dá)模式分析
4.3.1.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在野生型藍(lán)藻S149 中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.1.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍(lán)藻S149時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.2 KaiC基因在藍(lán)藻nktc-cikA-m中的表達(dá)模式分析
4.3.2.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻nktc-cikA-m中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.2.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍(lán)藻nktc-cikA-m時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.3 KaiC基因在野生型藍(lán)藻nktc-rpaA-m中的表達(dá)模式分析
4.3.3.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻nktc-rpaA-m中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.3.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍(lán)藻nktc-rpaA-m時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.4 KaiC基因在nktc1 突變?cè)逯曛械谋磉_(dá)模式分析
4.3.4.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在nktc1 突變?cè)逯曛械墓?jié)律性表達(dá)模式
4.3.4.2 25℃/30℃低溫溫度馴化nktc1 突變?cè)逯陼r(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.5 KaiC基因在藍(lán)藻19T-CikA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.5.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻19T-CikA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.5.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻19T-CikA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.6 KaiC基因在藍(lán)藻19T-RpaA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.6.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻19T-RpaA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.6.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻19T-RpaA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.7 KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.7.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.7.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻NS-CikA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.8 KaiC基因在藍(lán)藻NS-RpaA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.8.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻NS-RpaA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.8.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻NS-RpaA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.9 KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-RpaA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.9.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-RpaA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.9.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻NS-CikA-RpaA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝
本文編號(hào)：3866631
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摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
1.1 藍(lán)藻生物鐘研究進(jìn)展
1.1.1 藍(lán)藻生物鐘Kai核心震蕩器的研究進(jìn)展
1.1.2 藍(lán)藻Kai生物鐘的離體震蕩研究進(jìn)展
1.1.3 與Kai生物節(jié)律性震蕩器相關(guān)的其他生物鐘組件研究進(jìn)展
1.2 溫度信號(hào)在藍(lán)藻生物鐘運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控中作用的研究進(jìn)展
1.2.1 環(huán)境溫度信號(hào)可以影響生物鐘相位牽引的過程
1.2.2 生物鐘節(jié)律性的溫度補(bǔ)償特性研究進(jìn)展
1.2.3 環(huán)境溫度條件對(duì)生物節(jié)律性的限制作用研究進(jìn)展
1.3 非Kai生物鐘溫度調(diào)控因子突變體nktc1(Non-Kai thermo-regulatory component,nktc1)
1.4 本論文的主要研究?jī)?nèi)容
第二章 nktc1藍(lán)藻突變體突變位點(diǎn)的確定
2.1 引言
2.2 材料與方法
2.2.1 材料
2.2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
2.2.1.2 主要試劑
2.2.1.3 主要儀器設(shè)備
2.2.2 方法
2.2.2.1 全基因組測(cè)序初步檢測(cè)和定位nktc1突變體的突變位點(diǎn)
2.2.2.2 使用基因工程手段對(duì)基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行克隆測(cè)序,并驗(yàn)證其真實(shí)性
2.2.2.2.1 分子克隆中用到的引物
2.2.2.2.2 目的基因片段的PCR擴(kuò)增體系及程序
2.2.2.2.3 PCR產(chǎn)物的測(cè)序和在線序列信息比對(duì)
2.3 結(jié)果
2.3.1 nktc1突變體基因組中的突變位點(diǎn)分析
2.3.1.1 nktc1突變體藍(lán)藻全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的潛在突變位點(diǎn)分析
2.3.1.2 誘變親本藍(lán)藻S149全基因組測(cè)序SNP位點(diǎn)分析
2.3.1.3 全基因組測(cè)序結(jié)果的比較分析
2.3.2 假定nktc1突變位點(diǎn)的分子克隆及測(cè)序驗(yàn)證
2.3.2.1 不同藻株中CikA基因表達(dá)框序列比對(duì)結(jié)果
2.3.2.1.1 藍(lán)藻數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的野生型CikA基因表達(dá)框序列
2.3.2.1.2 藍(lán)藻S149經(jīng)PCR克隆得到的CikA基因表達(dá)框序列
2.3.2.1.3 nktc1 突變體中經(jīng)PCR克隆得到的nktc-cikA突變基因ORF序列測(cè)序結(jié)果
2.3.2.2 不同藻株中RpaA序列測(cè)序結(jié)果
2.3.2.2.1 藍(lán)藻數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的野生型RpaA基因序列
2.3.2.2.2 基因克隆測(cè)序得到S149內(nèi)RpaA序列
2.3.2.2.3 基因克隆測(cè)序得到nktc1內(nèi)PCR克隆測(cè)序結(jié)果如下RpaA序列
2.4 討論
第三章 nktc1 突變回復(fù)藍(lán)藻藻株的基因工程構(gòu)建及單一nktc位點(diǎn)突變重構(gòu)藻株的獲得
3.1 引言
3.2 材料及方法
3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
3.2.2.1 攜帶nktc-cikA突變位點(diǎn)的藍(lán)藻轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
3.2.2.2 攜帶nktc-rpaA突變位點(diǎn)的藍(lán)藻轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建
3.2.2.3 nktc-cikA突變?cè)换貜?fù)載體的構(gòu)建
3.2.2.4 nktc-rpaA突變?cè)换貜?fù)載體的構(gòu)建
3.2.2.5 突變重建藍(lán)藻藻株和突變回復(fù)藍(lán)藻藻株的獲得
3.3 結(jié)果
3.3.1 nktc-cikA或 nktc-rpaA突變位點(diǎn)重建載體及nktc突變位點(diǎn)回復(fù)載體的構(gòu)建
3.3.1.1 nktc-cikA突變重建載體的構(gòu)建及nktc-cikA突變位點(diǎn)重構(gòu)藍(lán)藻藻株的驗(yàn)證
3.3.1.2 nktc-rpaA突變重建載體的構(gòu)建及nktc-rpaA突變位點(diǎn)重構(gòu)藍(lán)藻藻株的驗(yàn)證
3.3.1.3 nktc-cikA突變?cè)换貜?fù)載體19T-CikA-R的構(gòu)建
3.3.1.4 nktc-rpaA突變?cè)换貜?fù)載體19T-RpaA-R的構(gòu)建
3.3.1.5 nktc1 突變體的異位回復(fù)株系NS-CikA-R和 NS-RpaA-R及異位雙回復(fù)株系的NS-CikA-RpaA-R的驗(yàn)證
3.4 討論
第四章 nktc-cikA和 nktc-rpaA突變對(duì)藍(lán)藻生物鐘節(jié)律性溫度補(bǔ)償表型的影響分析
4.1 引言
4.2 材料與方法
4.2.1 材料
4.2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
4.2.1.2 主要試劑
4.2.1.3 主要儀器設(shè)備
4.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
4.2.2.1 RT-qPCR檢測(cè)KaiC基因在不同藍(lán)藻株系中的時(shí)序表達(dá)模式
4.2.2.1.1 不同藍(lán)藻株系在溫度馴化條件下時(shí)序樣本的收集
4.2.2.1.2 TRIzol法進(jìn)行總RNA的提取
4.2.2.1.3 基因組DNA的去除及c DNA的合成與純化
4.2.2.1.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)
4.2.2.2 Western Blot檢測(cè)KaiC蛋白磷酸化節(jié)律性在不同藍(lán)藻藻株中的表型
4.2.2.2.1 用于Western Blot實(shí)驗(yàn)蛋白提取的藍(lán)藻時(shí)序樣本收集
4.2.2.2.2 藍(lán)藻蛋白的提取
4.2.2.2.3 蛋白電泳
4.2.2.2.4 Western blot
4.3 結(jié)果
4.3.1 KaiC基因在野生型藍(lán)藻S149中的表達(dá)模式分析
4.3.1.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在野生型藍(lán)藻S149 中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.1.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍(lán)藻S149時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.2 KaiC基因在藍(lán)藻nktc-cikA-m中的表達(dá)模式分析
4.3.2.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻nktc-cikA-m中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.2.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍(lán)藻nktc-cikA-m時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.3 KaiC基因在野生型藍(lán)藻nktc-rpaA-m中的表達(dá)模式分析
4.3.3.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻nktc-rpaA-m中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.3.2 25℃/30℃低溫溫度馴化野生型藍(lán)藻nktc-rpaA-m時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.4 KaiC基因在nktc1 突變?cè)逯曛械谋磉_(dá)模式分析
4.3.4.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在nktc1 突變?cè)逯曛械墓?jié)律性表達(dá)模式
4.3.4.2 25℃/30℃低溫溫度馴化nktc1 突變?cè)逯陼r(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.5 KaiC基因在藍(lán)藻19T-CikA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.5.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻19T-CikA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.5.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻19T-CikA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.6 KaiC基因在藍(lán)藻19T-RpaA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.6.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻19T-RpaA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.6.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻19T-RpaA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.7 KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.7.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.7.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻NS-CikA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.8 KaiC基因在藍(lán)藻NS-RpaA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.8.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻NS-RpaA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.8.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻NS-RpaA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.3.9 KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-RpaA-R中的表達(dá)模式分析
4.3.9.1 RT-qPCR的方法分析KaiC基因在藍(lán)藻NS-CikA-RpaA-R中的節(jié)律性表達(dá)模式
4.3.9.2 25℃/30℃低溫溫度馴化藍(lán)藻NS-CikA-RpaA-R時(shí)序樣本中KaiC磷酸化狀態(tài)的節(jié)律性表型的Western Blot分析
4.4 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝
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