核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)通過對模板分子進(jìn)行百萬倍擴(kuò)增來實(shí)現(xiàn)對核酸的高靈敏檢測,在食品安全檢測領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。但目前的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)主要局限于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用,不適用于現(xiàn)場快速檢測。本課題以食源性致病菌和轉(zhuǎn)基因作物為研究對象,從核酸提取、核酸擴(kuò)增和核酸檢測三個(gè)方面展開研究,開發(fā)了快速、簡便、可視化的檢測方法用于食品安全快速檢測,并且開發(fā)了可視化的DNA分子計(jì)數(shù)方法對樣本中的模板分子進(jìn)行計(jì)數(shù)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:(1)本課題采用環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增和基于磷酸根的可視化檢測方法對加標(biāo)對蝦樣本中的副溶血性弧菌進(jìn)行快速檢測。首先,采用棉簽擦拭加標(biāo)對蝦樣本進(jìn)行取樣;然后,采用NaOH溶液對獲得的樣本進(jìn)行快速細(xì)胞裂解,并將細(xì)胞裂解液稀釋10倍后直接作為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增;最后采用磷酸根比色法對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行可視化檢測。結(jié)果顯示,該可視化檢測方法對純培養(yǎng)的副溶血性弧菌的檢測限為2.63×10³ CFU/mL,對加標(biāo)對蝦樣本中的副溶血性弧菌的檢測限為3.00×10³ CFU/g。采用傳統(tǒng)菌落培養(yǎng)計(jì)數(shù)法做為標(biāo)準(zhǔn)對照,對151個(gè)對蝦樣本進(jìn)行可視化檢測。結(jié)果顯示可視化檢測方法...

【文章頁數(shù)】：152 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
英文縮略表
1 緒論
    1.1 課題背景
        1.1.1 食源性致病菌快速檢測重要性
        1.1.2 轉(zhuǎn)基因作物快速檢測重要性
        1.1.3 本節(jié)小結(jié)
    1.2 核酸擴(kuò)增檢測方法的基本模塊
        1.2.1 核酸提取
        1.2.2 核酸擴(kuò)增
        1.2.3 核酸檢測
        1.2.4 本節(jié)小結(jié)
    1.3 新型核酸擴(kuò)增方法及應(yīng)用進(jìn)展
        1.3.1 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)
        1.3.2 重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)
        1.3.3 快速PCR擴(kuò)增技術(shù)
    1.4 核酸終點(diǎn)檢測面臨的問題
    1.5 研究目的、內(nèi)容和技術(shù)路線
        1.5.1 研究目的和內(nèi)容
        1.5.2 技術(shù)路線
    1.6 本章小結(jié)
2 熱塊上的核酸恒溫?cái)U(kuò)增與比色法可視化檢測方法建立
    2.1 引言
    2.2 實(shí)驗(yàn)部分
        2.2.1 材料和試劑
        2.2.2 儀器設(shè)備
        2.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 LAMP擴(kuò)增靈敏度和特異性評估
        2.3.2 快速核酸提取方法的靈敏度評估
        2.3.3 棉簽擦拭取樣檢測加標(biāo)對蝦樣本中的副溶血性弧菌
        2.3.4 棉簽擦拭取樣法與傳統(tǒng)勻質(zhì)取樣法靈敏度比較
        2.3.5 磷酸根比色法檢測加標(biāo)對蝦樣本中的副溶血性弧菌
    2.4 本章小結(jié)
3 交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增加速劑探究及便攜式、防污染試紙條裝置開發(fā)
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)部分
        3.2.1 材料和試劑
        3.2.2 儀器設(shè)備
        3.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 普魯蘭多糖對CPA擴(kuò)增加速作用探究
        3.3.2 普魯蘭多糖作為CPA擴(kuò)增加速劑用于轉(zhuǎn)基因大米DNA檢測
        3.3.3 密閉性、便攜式、防污染試紙條裝置開發(fā)
    3.4 本章小結(jié)
4 無需熱塊的核酸恒溫?cái)U(kuò)增及熒光可視化檢測方法建立
    4.1 引言
    4.2 實(shí)驗(yàn)部分
        4.2.1 材料和試劑
        4.2.2 儀器設(shè)備
        4.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 不同長度的引物對RPA擴(kuò)增的影響
        4.3.2 RPA擴(kuò)增特異性和靈敏度測定
        4.3.3 RPA擴(kuò)增對非純化DNA模板的兼容性評估
        4.3.4 體溫觸發(fā)RPA擴(kuò)增的可行性評估
        4.3.5 熒光可視化檢測的可行性評估
        4.3.6 體溫觸發(fā)的RPA擴(kuò)增及可視化檢測用于GTS40-3-2 轉(zhuǎn)基因大豆篩查
        4.3.7 一體化非開蓋裝置用于RPA可視化檢測
    4.4 本章小結(jié)
5 快速PCR擴(kuò)增用于可視化DNA分子計(jì)數(shù)方法建立
    5.1 引言
    5.2 實(shí)驗(yàn)部分
        5.2.1 材料和試劑
        5.2.2 儀器設(shè)備
        5.2.3 實(shí)驗(yàn)方法
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 細(xì)柔性塑料管中的熱傳導(dǎo)過程建模分析
        5.3.2 快速PCR擴(kuò)增時(shí)樣本溫度實(shí)時(shí)變化過程
        5.3.3 快速PCR擴(kuò)增體系探究
        5.3.4 快速PCR擴(kuò)增的靈敏度測定
        5.3.5 擴(kuò)散和對流效應(yīng)對擴(kuò)增子熒光簇的影響
        5.3.6 擴(kuò)增子熒光簇?cái)?shù)目與DNA分子個(gè)數(shù)關(guān)系
        5.3.7 快速PCR擴(kuò)增用于單分子水平DNA檢測的可靠性評估
    5.4 本章小結(jié)
6 全文總結(jié)與展望
    6.1 主要研究結(jié)論
    6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
    6.3 進(jìn)一步研究展望
參考文獻(xiàn)
作者簡歷



本文編號：3847342