【目的】同時敲除苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)基因組的Ac148、Ac149、Ac150(Ac148-150)基因,檢測敲除Ac148-150基因片段對AcMNPV復制和外源蛋白表達能力的影響,為基因功能鑒定和縮小桿狀病毒基因組提供參考�！痉椒ā坷肦ed/ET同源重組系統(tǒng)和rpsL-AMP反向篩選系統(tǒng)對Ac148-150基因進行敲除,得到敲除型桿狀病毒質粒(KOAc148-150桿狀病毒質粒),提取AcMNPV KOAc148-150桿狀病毒質粒和野生型桿狀病毒質粒,將其分別與報告基因表達載體共轉染Sf9細胞,成功構建重組桿狀病毒(野生型病毒vAcMNPV/GFP和缺失突變病毒vAc△148-150/GFP),測定2種重組桿狀病毒的一步生長曲線并比較其差異。將2種重組桿狀病毒感染Sf9細胞后,采用熒光顯微鏡觀察GFP熒光細胞分布,用流式細胞儀檢測GFP熒光強度,再通過SDS-PAGE和Western blot檢測Ac148-150缺失突變體表達的GFP產(chǎn)量�！窘Y果】菌落PCR結果表明,AcMNPV中Ac148-150基因敲除成功。缺失突變病毒vAc△148-150/GFP...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材 料
        1.1.1 菌株、質粒和細胞系
        1.1.2 主要試劑
    1.2 方 法
        1.2.1 AcMNPV KOAc148-150桿狀病毒質粒的構建
            (1)含有Ac148-150基因兩側同源臂rpsl-AMP片段的擴增。
            (2)AcMNPV Ac148-150的敲除。
            (3)敲除Ac148-150基因菌落的篩選。
        1.2.2 重組桿狀病毒的構建
        1.2.3 重組桿狀病毒一步生長曲線的測定
        1.2.4 熒光顯微鏡分析重組桿狀病毒在Sf9細胞中GFP的表達情況
        1.2.5 流式細胞儀分析重組桿狀病毒在Sf9細胞中GFP的表達
        1.2.6 SDS-PAGE和Western blot檢測重組桿狀病毒在Sf9細胞中GFP的表達情況
2 結果與分析
    2.1 AcMNPV-rpsl-AMP片段的擴增
    2.2 敲除Ac148-150基因AcMNPV陽性菌落的鑒定
    2.3 重組桿狀病毒的檢測
    2.4 重組桿狀病毒在Sf9細胞中GFP的表達
        2.4.1 熒光顯微鏡法分析
        2.4.2 流式細胞儀分析
        2.4.3 SDS-PAGE和Western blot檢測
3 討 論



本文編號：3842571