羥基酪醇(hydroxytyrosol,HT)是一種主要存在于橄欖中的天然多酚類化合物,具有多種有益健康的生物學(xué)和藥理學(xué)活性,如抗氧化、抗癌、抗菌、消炎、預(yù)防心腦血管疾病和糖尿病、保護視網(wǎng)膜和骨質(zhì),在醫(yī)藥、食品和化妝品等行業(yè)具有巨大的應(yīng)用潛力。鑒于目前HT合成方法存在的不足,本研究提出了一種用重組大腸桿菌全細(xì)胞催化L-DOPA(L-3,4-二羥基苯丙氨酸)合成HT的方法,具有經(jīng)濟、簡便和高效的特點,有望為HT的工業(yè)化生產(chǎn)和實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:(1)在本實驗室前期工作篩選出的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶(TyrB)、α-酮酸脫羧酶(PmKDC)、醛還原酶(YahK)和L-谷氨酸脫氫酶(GluDH)的基礎(chǔ)上,提出了HT的合成途徑。在這個途徑中,L-DOPA通過TyrB的轉(zhuǎn)氨作用轉(zhuǎn)化為3,4-二羥基苯丙酮酸,后者進一步通過PmKDC的脫羧作用轉(zhuǎn)化為3,4-二羥基苯乙醛,最后,3,4-二羥基苯乙醛被YahK還原成HT,同時巧妙利用GluDH將轉(zhuǎn)氨反應(yīng)和還原反應(yīng)耦合起來,實現(xiàn)輔因子再生。以四酶混合催化的方式成功驗證了該途徑的可行性。(2)將這四個酶以雙質(zhì)粒共表達(dá)的方式構(gòu)建了一系列共表...

【文章頁數(shù)】：55 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 羥基酪醇簡介
        1.1.1 HT的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)
        1.1.2 HT的功能與應(yīng)用
    1.2 HT的合成方法
        1.2.1 植物提取
        1.2.2 化學(xué)合成
        1.2.3 生物合成
    1.3 多基因共表達(dá)
    1.4 NAD(P)H輔酶再生
    1.5 全細(xì)胞催化
    1.6 立題依據(jù)
    1.7 研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 實驗儀器設(shè)備
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.2.2 質(zhì)粒DNA的提取和PCR產(chǎn)物純化
        2.2.3 菌株的培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)及全細(xì)胞催化劑的制備
        2.2.4 HT合成途徑可行性驗證
        2.2.5 HT的測定方法
        2.2.6 基因克隆和共表達(dá)菌株的構(gòu)建
        2.2.7 瓊脂糖凝膠電泳和SDS-PAGE
        2.2.8 酶活的測定方法
        2.2.9 培養(yǎng)基優(yōu)化和誘導(dǎo)條件優(yōu)化
        2.2.10 全細(xì)胞催化及其條件優(yōu)化
        2.2.11 HT的初步分離純化
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 HT合成途徑可行性驗證
    3.2 共表達(dá)菌株的構(gòu)建及其產(chǎn)HT能力比較
        3.2.1 共表達(dá)菌株的構(gòu)建
        3.2.2 共表達(dá)菌株的產(chǎn)HT能力比較
        3.2.3 四酶共表達(dá)的驗證
    3.3 培養(yǎng)基優(yōu)化
        3.3.1 培養(yǎng)基種類優(yōu)化
        3.3.2 碳源及其濃度優(yōu)化
        3.3.3 氮源及其濃度優(yōu)化
        3.3.4 無機鹽及其濃度優(yōu)化
        3.3.5 培養(yǎng)基組分配比的正交實驗優(yōu)化
    3.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化
        3.4.1 誘導(dǎo)時機優(yōu)化
        3.4.2 IPTG濃度優(yōu)化
        3.4.3 誘導(dǎo)溫度優(yōu)化
        3.4.4 誘導(dǎo)時長優(yōu)化
    3.5 全細(xì)胞催化條件優(yōu)化
        3.5.1 pH優(yōu)化
        3.5.2 溫度優(yōu)化
        3.5.3 轉(zhuǎn)速優(yōu)化
    3.6 優(yōu)化條件下的HT合成
    3.7 HT的初步分離純化
主要結(jié)論與展望
    主要結(jié)論
    展望
致謝
參考文獻
附錄1 :作者在攻讀碩士學(xué)位期間的科研成果
附錄2 :基因序列



本文編號：3817895