近年來,CRISPR已成為對抗外源逆轉錄病毒病原體和器官移植中滅活內源性逆轉錄病毒的重要且有前途的工具。CRISPR-Cas系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated systems)是細菌及古生菌產生和進化的抵御外來遺傳物質入侵的適應性免疫系統(tǒng),通過形成cr RNA(CRISPR RNA)-效應蛋白復合物,識別并破壞特定的外源序列,比如噬菌體病毒和外源DNA,某些情況下為RNA�；谠撓到y(tǒng)的特性,現(xiàn)已開發(fā)出一系列高效的基因編輯工具,被廣泛應用于對各宿主基因組進行編輯。CRISPR-Cas12a蛋白,屬于CRISPR核酸內切酶家族的2類V型蛋白,缺乏HNH結構域,具有單個Ruv C核酸酶結構域和一個推定的Nuc結構域,分別負責兩條DNA鏈的切割。Cas12a蛋白同時具有DNA和RNA核酸酶活性,可實現(xiàn)對多個基因的同時編輯,常在細菌、植物和哺乳動物細胞中調節(jié)異源DNA編輯。2類VI型CRISPR-Cas13效應蛋白,具有特異地靶向和切割單鏈RNA而不是雙鏈DNA底物的獨特能力。...

【文章頁數】：68 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)
        1.1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機制
        1.1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類及應用現(xiàn)狀
    1.2 CRISPR-Cas12a:高效的DNA編輯工具
        1.2.1 CRISPR-Cas12a蛋白的作用特點
        1.2.2 CRISPR-Cas12a系統(tǒng)的應用研究
    1.3 CRISPR-Cas13a:靶向RNA的 CRISPR效應蛋白
        1.3.1 CRISPR-Cas13a蛋白的作用特點
        1.3.2 CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的應用研究
    1.4 逆轉錄轉座子與逆轉錄病毒
        1.4.1 逆轉錄轉座子與逆轉錄病毒的相似性
        1.4.2 CRISPR技術抑制/干擾逆轉錄病毒的研究
    1.5 本研究的目的意義及主要內容
2 裂殖酵母中CRISPR-Cas12a基因編輯系統(tǒng)的實施和優(yōu)化
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 引物、質粒和菌株
        2.2.2 試劑和儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 裂殖酵母的轉化培養(yǎng)及生長速率的測定
        2.3.2 靶向MEL1 基因的Cas12a系統(tǒng)構建
        2.3.3 donor DNA的獲取
    2.4 實驗結果與分析
        2.4.1 整合表達Fn Cas12a和 Lb Cas12a蛋白對裂殖酵母影響
        2.4.2 在裂殖酵母中實施CRISPR-Cas12a編輯系統(tǒng)
        2.4.3 優(yōu)化裂殖酵母中CRISPR-Cas12a系統(tǒng)
3 利用CRISPR-Cas12a編輯系統(tǒng)干擾裂殖酵母逆轉錄轉座子Tf1 的轉座
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 引物,質粒和菌株
        3.2.2 試劑和儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 含有人工內含子的Tf1逆轉座報告系統(tǒng)的構建
        3.3.2 靶向NEO基因的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)構建
        3.3.3 裂殖酵母逆轉座子Tf1轉座效率的測定
    3.4 實驗結果與分析
        3.4.1 構建Tf1轉座報告系統(tǒng),用于裂殖酵母的轉座干擾分析
        3.4.2 CRISPR-Cas12a干擾Tf1 逆轉座且仍有殘留的轉座活性
        3.4.3 通過延長cr RNA靶向作用,CRISPR-Cas12a可完全消除Tf1 轉座活性
4 利用CRISPR-Cas13a編輯系統(tǒng)干擾裂殖酵母逆轉錄轉座子Tf1 的轉座
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 引物,質粒和菌株
        4.2.2 試劑和儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 靶向Tf1 轉錄本的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)構建
        4.3.2 裂殖酵母逆轉座子Tf1轉座效率的測定
    4.4 實驗結果與分析
        4.4.1 CRISPR-Cas13a靶向Tf1 RNA中間體干擾Tf1 逆轉座
        4.4.2 Tf1 轉錄本激活Cas13a不會誘導裂殖酵母細胞生長停滯
5 總結與展望
    5.1 全文總結
    5.2 展望
參考文獻
附錄A 基本實驗操作
攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄
致謝



本文編號：3815420