冠狀病毒是一類對人類和動物均造成嚴重危害的病原體,對世界各國的經(jīng)濟發(fā)展、農(nóng)業(yè)發(fā)展、公共衛(wèi)生安全等均造成嚴重危害,其中豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和貓傳染性腹膜炎病毒(Feline infectious peritonitis virus,FIPV)對動物健康構(gòu)成了嚴重威脅,二者均為α屬冠狀病毒。豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)的致死率極高,尤其免疫功能尚未完善的仔豬,其死亡率為100%。目前,該病的防控主要依靠疫苗,但是在臨床上不能提供100%保護,并且尚無可對該病進行有效防控與治療的特效藥物。貓傳染性腹膜炎(Feline infectious peritonitis,FIP)是目前危害貓科動物健康的重要疾病之一,傳染性高且致死率為100%。臨床治療中3C樣蛋白酶(3C-like protease,3CL^pro)抑制劑GC376得到了廣泛使用,目前該抑制劑在治療前期取得了較好療效,但停藥后發(fā)現(xiàn)存在復發(fā)現(xiàn)象,影響治療的效果,降低治愈率。本研究首次證明3CL

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviation)
1 文獻綜述
    1.1 冠狀病毒3CLpro

        1.1.1 冠狀病毒概述
        1.1.2 冠狀病毒基因組學及復制過程
        1.1.3 冠狀病毒3CL^pro相關進展
        1.1.4 3CL^pro抑制劑研究進展
    1.2 豬流行性腹瀉研究進展
        1.2.1 豬流行性腹瀉概述
        1.2.2 豬流行性腹瀉病毒3CL^pro研究進展
        1.2.3 豬流行性腹瀉的防治措施
    1.3 貓傳染性腹膜炎研究進展
        1.3.1 貓傳染性腹膜炎概述
        1.3.2 貓傳染性腹膜炎的治療
2 目的與意義
3 材料與方法
    3.1 實驗材料
        3.1.1 毒株、菌株、細胞與載體
        3.1.2 主要試劑與藥品
        3.1.3 主要儀器與設備
        3.1.4 主要試劑的配制
        3.1.5 生物學軟件及數(shù)據(jù)庫
        3.1.6 實驗所用引物
        3.1.7 實驗所用熒光多肽底物
    3.2 實驗方法
        3.2.1 細胞傳代培養(yǎng)
        3.2.2 病毒毒價的測定(TCID₅₀)
        3.2.3 PEDV病毒的擴增
        3.2.4 抑制劑GC376對病毒抑制效果評定
        3.2.5 PEDV3CL^pro的表達與純化
        3.2.6 FRET測定不同熒光底物的特異性
        3.2.7 分子對接模擬PEDV3CL^pro與GC376 的結(jié)合
        3.2.8 FIPV耐藥毒株的蝕斑純化
        3.2.9 RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄反應
        3.2.10 FIPV耐藥毒株全基因組PCR擴增與突變位點分析
4 結(jié)果分析
    4.1 PEDV3CL^pro的表達與純化
        4.1.1 質(zhì)粒構(gòu)建
        4.1.2 3CL^pro的大量表達純化
    4.2 抑制劑GC376對PEDV的抑制效果
        4.2.1 抑制劑GC376對PEDV3CL^pro的IC50
        4.2.2 抑制劑GC376 在細胞培養(yǎng)中PEDV流行毒株的抑制效果
        4.2.3 Western blot檢測GC376對PEDV的抑制效果
        4.2.4 IFA法檢測GC376對PEDV的抑制效果
    4.3 模擬PEDV3CL^pro與抑制劑GC376 的結(jié)合模式
    4.4 PEDV3CL^pro的底物特異性
    4.5 抑制劑GC376的優(yōu)化
    4.6 確定FIPV藥物壓力下的傳代方法
    4.7 50代FIPV的毒價與耐藥性變化
    4.8 通過蝕斑純化法獲得耐藥性毒株
    4.9 抑制劑GC376 對野生型FIPV與耐藥毒株的抑制效果
        4.9.1 抑制劑GC376 細胞培養(yǎng)中對野生型FIPV與耐藥毒株的抑制效果
        4.9.2 IFA法檢測GC376 對野生型FIPV與耐藥毒株的抑制效果
        4.9.3 Western Blot檢測GC376 對野生型FIPV與耐藥毒株的抑制效果
    4.10 耐藥性毒株突變位點的分析
5 討論
    5.1 抑制劑GC376對PEDV的有效抑制作用
    5.2 抑制劑GC376對其他冠狀病毒的抑制效果
    5.3 關于抑制劑GC376的優(yōu)化方向
    5.4 冠狀病毒對抑制劑GC376產(chǎn)生耐藥性的分子機制
    5.5 抑制劑GC376作為新型冠狀病毒候選藥物的潛力
    5.6 后續(xù)可開展的研究工作
6 結(jié)論
參考文獻
致謝



本文編號：3797459

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