發(fā)布時間：2023-04-03 23:51

　　目的構(gòu)建含RUNX1c及GATA2基因的表達質(zhì)粒,探討水動力轉(zhuǎn)染法能否實現(xiàn)其在小鼠肝中的表達。方法采用PCR方法分別擴增RUNX1c及GATA2基因序列,并分別連入T載體中,通過雙酶切、連接反應(yīng)將2個基因序列分別連入慢病毒載體pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中。將含RUNX1c及GATA2基因的慢病毒毒液轉(zhuǎn)染至L-02細胞,通過qPCR方法檢測目的基因表達。通過水動力高壓轉(zhuǎn)染方法將此兩種質(zhì)粒通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi),于轉(zhuǎn)染24 h,取小鼠肝組織,對組織切片進行抗RUNX1及GATA2抗體的免疫熒光染色;于轉(zhuǎn)染72 h,通過流式細胞術(shù)分選肝組織中GFP+細胞,實時定量PCR(qPCR)檢測RUNX1c、GATA2及造血相關(guān)基因的表達。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測序鑒定證明,pCDH-MCS-T2A-RUNX1c-copGFP-MSCV、pCDH-MCS-T2A-GATA2-copGFP-MSCV質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過體外實驗證實這兩個載體攜帶的RUNX1c及GATA2基因能在人肝細胞系L-02中表達。水動力高壓轉(zhuǎn)染法可使含RUNX1c及GATA2的質(zhì)粒進入肝組織,并在肝細胞中表達RUNX1...

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【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 基因、質(zhì)粒、菌株、細胞
        1.1.2 實驗動物
        1.1.3 試劑和設(shè)備
    1.2 方法
        1.2.1 RUNX1c和GATA2引物的設(shè)計與合成
        1.2.2 RUNX1c和GATA2基因片段的PCR擴增
        1.2.3 RUNX1c和GATA2重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
        1.2.4 水動力轉(zhuǎn)染質(zhì)粒
        1.2.5 流式細胞術(shù)檢測
        1.2.6 組織切片免疫熒光和免疫組化染色
        1.2.7 慢病毒毒液感染L-02細胞
    1.3 統(tǒng)計學分析
2結(jié)果
    2.1 RUNX1c基因表達載體的構(gòu)建
    2.2 GATA2基因表達載體的構(gòu)建
    2.3攜帶RUNX1c、GATA2基因的慢病毒毒液包裝及感染L-02細胞
    2.4水動力轉(zhuǎn)染RUNX1c及GATA2的表達質(zhì)粒及其在肝中表達的檢測
    2.5攜帶RUNX1c及GATA2基因的質(zhì)粒在肝細胞中的表達
    2.6 RUNX1c及GATA2基因表達后啟動造血相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達
3討論



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