近年來(lái)以CRISPR/Cas9為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速,其廣泛應(yīng)用于細(xì)胞模型和活體轉(zhuǎn)基因模型的建立。研究者大多采用靶位點(diǎn)sgRNA聯(lián)合Cas9蛋白顯微注射到動(dòng)物胚胎實(shí)現(xiàn)活體水平目的基因的編輯。為探討能否利用CRISPR/Cas9實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體肌肉組織特異的基因編輯,本研究利用Rosa26基因的廣譜性表達(dá),在此基因位置發(fā)生序列變化不影響其他基因功能的特性,將Cas9基因連接到人工合成的肌肉特異表達(dá)啟動(dòng)子(SP啟動(dòng)子)下游,在C2C12(骨骼肌細(xì)胞的前體細(xì)胞)中檢測(cè)該系統(tǒng)的編輯效率,在此基礎(chǔ)上構(gòu)建Rosa26位點(diǎn)的同源重組載體,該載體可以整合到C2C12細(xì)胞和小鼠胚胎,為肌肉組織特異的基因編輯研究奠定基礎(chǔ)。具體情況如下:1.PX459-Rosa26-SP-DsRed示蹤載體的構(gòu)建將實(shí)驗(yàn)室前期工作中構(gòu)建PX459-Rosa26(該載體帶有針對(duì)Rosa26位點(diǎn)的sgRNA片段)的CMV啟動(dòng)子替換為肌肉特異啟動(dòng)子SP,構(gòu)建PX459-Rosa26-SP載體。XbaI酶切未切開(kāi)顯示打靶后C2C12細(xì)胞的XbaI位點(diǎn)破壞,T7E1切開(kāi)顯示發(fā)生切割并NHEJ修復(fù),該載體成功打靶Rosa26基因位點(diǎn),并...

【文章頁(yè)數(shù)】：64 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 緒論
    1.1 基因編輯技術(shù)
        1.1.1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展
        1.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)作用原理
        1.1.3 ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)的比較
        1.1.4 CRISPR/Cas9在細(xì)胞和動(dòng)物模型建立中的應(yīng)用
    1.2 時(shí)空特異性基因編輯
        1.2.1 條件性基因敲除
        1.2.2 組織特異性基因編輯
        1.2.3 肌肉特異性啟動(dòng)子SP
    1.3 基因敲入位點(diǎn)
        1.3.1 Rosa26位點(diǎn)基因敲入“安全港”
        1.3.2 AAVS腺病毒相關(guān)病毒整合位點(diǎn)
    1.4 研究的目的及意義
2 肌肉特異性表達(dá)Cas9示蹤載體的構(gòu)建
    2.1. 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 載體信息
        2.1.2 主要試劑和藥品
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 SP啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增
        2.2.2 Rosa26-PX459-SP載體構(gòu)建
        2.2.3 Rosa26-PX459-SP載體酶切
        2.2.4 PX459-Rosa26-SP-DsRed示蹤載體的構(gòu)建
        2.2.5 Rosa26-PX459-SP在C2C12細(xì)胞中編輯活性檢測(cè)
        2.2.6 PX459-Rosa26-SP-DsRed示蹤載體的檢測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 SP啟動(dòng)子的擴(kuò)增
        2.3.2 Rosa26-PX459-SP載體構(gòu)建
        2.3.3 Rosa26位點(diǎn)Cas9示蹤載體的構(gòu)建
        2.3.4 PX459-Rosa26-SP表達(dá)活性檢驗(yàn)
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
3 肌肉特異表達(dá)Cas9示蹤同源打靶載體在C2C12細(xì)胞中的整合
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)載體信息
        3.1.2 主要試劑及藥品
        3.1.3 主要設(shè)備及儀器
        3.1.4 溶液配制
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 同源臂載體Donor的酶切
        3.2.2 SP-Cas9-DsRed的克隆
        3.2.3 Donor-Cas9-SP-DsRed的連接
        3.2.4 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
        3.2.5 PCR鑒定基因敲入情況
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 同源打靶載體的構(gòu)建及表達(dá)活性檢測(cè)
        3.3.2 同源載體在C2C12細(xì)胞Rosa26位點(diǎn)的整合
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
4 肌肉特異表達(dá)Cas9示蹤載體在小鼠胚胎中的整合
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)載體信息
        4.1.3 藥品和試劑
        4.1.4 溶液配制
        4.1.5 主要儀器設(shè)備
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 注射用小鼠Rosa26基因sgRNA的制備
        4.2.2 小鼠Rosa26基因sgRNA體外編輯效率檢測(cè)
        4.2.3 小鼠胚胎的顯微注射
        4.2.4 小鼠Rosa26基因敲除胚胎編輯效率檢測(cè)
        4.2.5 同源打靶載體敲入胚胎編輯效率檢測(cè)
        4.2.6 胚胎移植
        4.2.7 出生小鼠基因分型檢測(cè)
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 Rosa26 sgRNA的體外編輯效率
        4.3.2 Rosa26 sgRNA在小鼠胚胎中的編輯效率
        4.3.3 同源重組載體敲入胚胎效率
        4.3.4 胚胎移植后的活體編輯效率
    4.4 討論
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3778088