發(fā)布時間：2023-02-26 04:48

　　目前,聚對苯二甲酸乙二醇酯塑料(PET)的廣泛使用已對生態(tài)環(huán)境造成嚴重污染,而焚燒和化學降解等方法帶來的二次污染同樣嚴峻,因此更為溫和的生物降解為PET的回收提供了可能性。據(jù)報道來源于Ideonella sakaiensis的塑料降解酶PETase表現(xiàn)出比其他酶更高的PET水解活性�？莶菅挎邨U菌是公認的生物安全性菌株,且具有強大的分泌能力,是良好的異源基因表達宿主。在基因表達中,啟動子是直接影響基因表達水平的重要基因組調控元件,而信號肽則決定了蛋白的外泌能力。所以外源基因的成功高效率表達不僅要選擇合適的宿主菌株,合適的啟動子和信號肽同樣重要。在本研究中,我們利用枯草芽孢桿菌對PETase進行外泌表達,并選擇了5個信號肽和2個啟動子來介導PETase的胞外分泌,并以天然信號肽SPPETase作為對照。通過正交設計,構建了7株工程菌,分別是:WB600-P43-SP_AprE,WB600-P43-SP_apr,WB600-P43-SP_BprA,WB600-P43-SP_SacC,WB600-P43-SP

【文章頁數(shù)】：57 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 PET簡介
        1.1.1 塑料污染
        1.1.2 PET合成
        1.1.3 PET回收處理
    1.2 PET生物降解
        1.2.1 PET生物降解簡介
        1.2.2 PET降解酶
        1.2.3 新型PET降解酶PETase

    1.3 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)與表達原件
        1.3.1 枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)
        1.3.2 啟動子對外源基因表達影響
        1.3.3 信號肽對外源基因表達影響
    1.4 酶分子的工程改造
        1.4.1 定向進化
        1.4.2 理性與半理性設計
    1.5 立題意義與主要研究內容
        1.5.1 立題意義
        1.5.2 主要研究內容
第二章 材料與方法
    2.1 試驗材料
        2.1.1 菌株與質粒
        2.1.2 主要儀器
        2.1.3 工具酶、引物與測序、試劑盒及試劑
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 相關溶液
    2.2 表達載體在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌中的表達純化及檢測
        2.2.1 表達載體在大腸桿菌(E.coli)TOP10 中的克隆
        2.2.2 表達載體在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達
        2.2.3 表達載體在枯草芽孢桿菌WB600中的表達
        2.2.4 表達蛋白的檢測
    2.3 酶活檢測方法
        2.3.1 p-NPP法測定蛋白質酶活
        2.3.2 蛋白水解BHET活性檢測
    2.4 啟動子及信號肽的篩選
        2.4.1 WB600-P43-SP_amy工程菌的構建
        2.4.2 培養(yǎng)溫度的確定
        2.4.3 WB600-P43-SP_sp工程菌的構建
        2.4.4 不同信號肽介導下PETase外泌情況
        2.4.5 WB600-Pylb-SP_amy工程菌的構建
        2.4.6 不同啟動子介導下PETase外泌情況
        2.4.7 掃描電鏡實驗
    2.5 半理性設計提高PETase的熱穩(wěn)定性
        2.5.1 突變位點的選擇
        2.5.2 突變表達載體的構建
        2.5.3 大腸桿菌BL21(DE3)突變工程菌株的構建及表達
        2.5.4 PETase及其突變體蛋白活性測定
        2.5.5 最適溫度測定
        2.5.6 熱穩(wěn)定性測定
        2.5.7 突變體rmsd、rmsf的確定及作用力的分析
第三章 結果與分析
    3.1 啟動子及信號肽篩選提高PETase在枯草芽孢桿菌中的表達量
        3.1.1 PETase重組表達菌株的構建
        3.1.2 工程菌培養(yǎng)溫度的測定
        3.1.3 不同信號肽對PETase分泌表達的影響
        3.1.4 不同啟動子對PETase分泌表達的影響
        3.1.5 檢測分泌的PETase水解BHET
        3.1.6 通過分泌的PETase檢測降解的PET膜
        3.1.7 小結
    3.2 半理性設計提高PETase的熱穩(wěn)定
        3.2.1 突變位點的選擇
        3.2.2 突變體的構建與表達
        3.2.3 單點突變體的初篩
        3.2.4 突變體酶學性質測定
        3.2.5 突變體穩(wěn)定性提高的分子機制
        3.2.6 小結
第四章 主要結論與展望
    4.1 主要結論
    4.2 展望
致謝
參考文獻
附錄 Ⅰ:作者在攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文
附錄 Ⅱ:英文縮略表



本文編號：3749849

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